Центрифугирование изопикническое

Во втором варианте проводят равновесное, или изопикническое, центрифугирование, при этом используют градиент, охватывающий весь диапазон плотности разделяемых частиц. На дно помещают раствор с плотностью, превышающей плотность самого тяжелого компонента смеси. Центрифугирование проводят до тех пор, пока все частицы не разделятся по зонам, соответствующим их собственной плотности. [c.66]

Осветленный и концентрированный вирус еще недостаточно чист для большинства биохимических и биофизических исследований. Дополнительной очистки достигают зональным (скоростным) или равновесным (изопикническим) центрифугированием. Теоретические и практические аспекты центрифугирования детально изложены в другом руководстве [7]. Для вирусов растений можно использовать следующие методы дополнительной очистки. [c.16]

Таблица 1.3. Изопикническое центрифугирование в градиентах плотности

Метод позволяет получить препарат средней степени чистоты. Дальнейшую очистку можно провести зональным или изопикническим центрифугированием, что требует использования ультрацентрифуги. [c.21]

При необходимости дальнейшую очистку проводят изопикническим центрифугированием. [c.22]

Изопикническое центрифугирование и центрифугирование в комбинированных зонально-плотностных градиентах [c.101]

J.2. Очистка РСВ методом изопикнического центрифугирования [c.151]

РАВНОВЕСНОЕ (ИЗОПИКНИЧЕСКОЕ) ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ [c.240]

Изопикническое центрифугирование проводят как в градиенте плотности, так и обычным путем. Если центрифугирование проводится не в градиенте плотности, препарат сначала центрифугируют так, чтобы осели частицы, молекулярный вес которых больше, чем у исследуемых частиц. Эти тяжелые частицы отбрасывают, и образец суспендируют в среде, плотность которой такая же, как и у [c.48]

Иногда в трехкомпонентной системе одна связующая прямая является особой или даже сингулярной. Это может быть результатом совпадения плотности обеих равновесных фаз в этом случае речь идет об изопикнической прямой [53]. При процессах экстракции растворителями такое явление исключает возможность разделения фаз путем отстаивания или центрифугирования поэтому по практическим соображениям его необходимо избегать, хотя оно и не имеет теоретического важного значения. [c.238]

Обычно миелин получают гемогенизацией нервной ткани с последующим фракционированием посредством центрифугирования в градиенте плотности. Его плотность составляет 1,08 г/мл, что позволяет применять изопикнические методы. Данные анализа, полученные различными исследователями, отличаются причиной могут быть примеси аксональной мембраны. [c.99]

Зонное центрифугирование при условии, что плотность вблизи дна кюветы выше, чем плотность любого из компонентов образца, было названо Андерсоном [51 изопикническим градиентным центрифугированием . В эксперименте этого типа ни один из компонентов не достигает дна ячейки, как бы долго ни продолжалось центрифугирование. Чрезвычайно удобный для такого рода препаративной работы ротор был описан Андерсоном [61. Он представляет собой полый цилиндр, разделенный на 36 секторов. [c.418]

Материал, полученный одним из описанных выше методов, обычно контаминирован клеточными компонентами. Однако в тех случаях, когда высокая степень очистки не обязательна (например, для постановки RIA или ELISA), его можно использовать уже на этой стадии. Тем не менее для большинства исследований необходима дальнейшая очистка вируса с помощью зонально-скоростного или изопикнического центрифугирования в градиенте. При скоростном центрифугировании положение вируса в градиенте определяется его коэффициентом седиментации, а при изопикническом — плавучей плотностью. Для достижения максимальной степени очистки вирусных частиц от примесей изменение концентрации образующего градиент вещества должно быть плавным в то же время на промежуточных стадиях очистки нередко используют ступенчатые градиенты. В некоторых случаях принципы скоростного и изопикнического центрифугирования совмещаются примером может служить использование градиентов глицерина — тартрата калия [14]. В таких градиентах концентрация тартрата калия возрастает в направлении дна пробирки, достигая плотности, соответствующей плавучей плотности вируса концентрация глицерина, наоборот, максимальна на мениске, что препятствует продвижению медленно седиментирующего материала в направлении дна. Все типы градиентов обычно центрифугируют в бакет-роторах, но в случае изопикнических градиентов такие же или даже лучшие результаты можно получить в угловых или вертикальных роторах с помощью приспособлений для медленного разгона и остановки, обеспечивающих переориентацию градиента без перемешивания. При очистке конкретного вируса часто приходится проводить целую серию последовательных стадий центрифугирования в разных типах градиентов, чтобы добиться нужной степени очистки. [c.100]

Для изопикнического центрифугирования большинства тогавирусов подходят 20—50%-ные (вес на вес) непрерывные линейные градиенты концентрации сахарозы. В комбинированных градиентах глицерина — тартрата калия [14] верхнюю (менее плотную) часть образует 30%-ный (вес на вес) раствор глицерина в 50 мМ трис-НС1, 1 мМ ЭДТА (pH 7,5), а нижнюю (более плотную)—50%-ный (вес на вес) раствор тартрата калия. pH раствора тартрата калия не должен быть ниже 8,5, так как при более кислых значениях образуется осадок. Из этих растворов обычными способами готовят линейные градиенты. Поскольку в таких градиентах вирус концентрируется в зоне с со- [c.101]

Получение вирусов из фракций градиентов. На последней стадии очистки необходимо удалить вещество, образующее градиент. На промежуточных стадиях обычно достаточно развести содержащие вирус фракции равным объемом буферного раствора, чтобы материал можно было непосредственно наносить на следующий изопикнический градиент. Поскольку для зонального центрифугирования объем образца должен быть небольшим, разведение фракций предыдущего градиента в этом случае, как правило, невозможно поэтому предпочтительно проводить зональное центрифугирование перед изопикническим, если используемая схема очистки включает оба варианта центрифугирования. Полного удаления вещества, образующего градиент, достигают диализом, гель-фильтрацией через колонку с сефадексом G-50 или разведением с последующим ультрацентрифугированием. Диализ очищенного материала проводят в нескольких сменах подходящего буферного раствора (например, GTNE, хотя в некоторых случаях для последующего использования очищенного вируса может потребоваться другой буфер). Колонку с сефадексом уравновешивают, пропуская через нее пятикратный по отношению к образцу объем того буферного раствора, в котором должен быть растворен очищенный вирус. Появление вируса в свободном объеме колонки при элюции регистрируют по поглощению в ультрафиолете или [c.103]

Данный метод требует более длительного центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы (16 ч при 73 000 g) или метризамида (15—45%-ный градиент, 190000 g, 6 ч). Растворы метризамида обладают более низкой вязкостью и осмотическим давлением, чем растворы сахарозы, и поэтому их использование для изопикнического центрифугирования предпочтительно. Растворы метризамида всегда следует готовить непосредственно перед использованием на 10 мМ HEPES, pH 7,8 [26]. [c.151]

Дальнейщую очистку вируса проводят повторным центрифугированием в градиенте. Применяют либо зональное центрифугирование в 15—60%-НОМ градиенте концентрации сахарозы, либо, предпочтительно, изопикническое центрифугирование в 20—45%-НОМ (вес на объем) градиенте плотности тартрата калия. [c.186]

Предложено два альтернативных метода очистки вируса. Стандартный метод Смита и др. [5] включает стадии зонального центрифугирования вируса в градиенте концентрации сахарозы я последующего изопикнического центрифугирования в градиенте плотности s l. [c.206]

Нуклеиновые кислоты, присутствующие в тканях в качестве нуклеопротеи-новых комплексов с основными белками, могут быть выделены либо прямо1"1 экстракцией, либо путем экстракции соответствующих нуклеопротеинов, обычно 1 М растворами солей. Растворимые нуклеопротеины диссоциируют пря насыщении раствора хлоридом натрия, который при этом осаждает белки, а в случае ДНК—изопикническим центрифугированием нуклеопротеина (разд. 7.2.7). Белки могут быть также отделены от нуклеиновых кислот экстракцией фенолом или обработкой детергентами, такими, как додецилсульфат натрия. После отделения белка нуклеиновую кислоту можно осадить, медленно добавляя спирт. [c.213]

Перед начален центрифугирования суспензию частиц наслаивают поверх градиента плотности жидкости (а). При скоростноы цеитрифугироваини частицы не достигают изопикни-ческой точки, а при изопикническом разделении центрифугирование продолжают до тех пор, пока исследуеыые частицы не достигнут зоны с соответствующей плотностью (б). [c.47]

Другой способ заключается в наслаивании образца на поверхность раствора с непрерывным градиентом плотности, охватывающим диапазон плотностей всех компонентов смеси. Центрифугирование проводят до тех пор, пока плавучая плотность частиц не сравняется с плотностью соответствующих зон, т. е. пока не произойдет разделение частиц по зонам. Метод получил название зснально-изопикнического, или рв -зонального центрифугирования, так как основным моментом здесь является плавучая плотность (рв), а не размеры или форма частиц (рис. 2.4). На величину плотности, при которой частицы образуют изопикнические полосы, влияет природа среды суспендирования частицы могут быть проницаемыми для одних соединений, находящихся в растворе, и непроницаемыми для других или же присоединять молекулы раствора. При использовании зонального ротора (разд. 2.5.3) митохондрии, лизосомы, перок-сисомы и микросомы концентрируются в полосах с 42 %-, 47%-, 47%-и 27%-НОЙ сахарозой, соответствующих плотности 1,18, 1,21, 1,21 и 1,10 г-см"3 соответственно. Плотность субклеточных органелл зависит также и от избирательного поглощения ими определен- [c.48]

Для HBV разработано несколько методов получения поверхностного антигена в клетках эукариот. Стимулом для этих разработок послужила острая необходимость в дешевой вакцине. Хотя имеющаяся в настоящее время разрешенная вакцина против HBV, содержащая (22 нм)-поверхностный антиген гепатита В (HBsAg), который получен из плазмы хронически инфицированных носителей, защищает от заболевания, высокая стоимость препятствует ее использованию в развивающихся странах, где нужда в эффективной иммунопрофилактике особенно велика. Возможно, эта ситуация скоро будет исправлена, поскольку в настоящее время антиген HBsAg получают из дрожжей в количествах, очевидно, достаточных для его поступления в продажу. Его экспрессия достигается при трансфекции дрожжей рекомбинантом, который содержит ген поверхностного антигена HBV, встроенный в плазмиду за индуцируемым промотором [ИЗ, 186]. Продуцируемый дрожжами HBsAg, очевидно, не гликозилирован, но иммуногенен в организме шимпанзе. После разрушения дрожжевых клеток антиген очищают с помощью изопикнического и скоростного зонального центрифугирования в комбинации с иммуноаффинной хроматографией [16, 186, 189]. [c.156]

Еще один метод разделения органелл основан на равновесном (изопикническом) центрифугировании в градиенте плотности. Полученный из листьев экстракт наслаивают иа градиент концентрации сахарозы и затем центрифугируют до тех пор, пока органеллы не достигнут равновесного положения в градиенте в соответствии с нх плавучей плотностью. Разделение оргаиелл в данном случае основано ие на различии в скорости нх седиментации, а на различии в их плотности. Пероксисомы имеют более высокую плавучую плотность, чем интактные хлоро-лласты, а интактные хлоропласты имеют более высокую плавучую плотность, чем интактные митохондрии. Обычно полученные из листьев экстракты наслаивают на градиент концентрации сахарозы (примерно 20—60% по весу), который затем центрифугируют в роторе с подвесными стаканами в течение 3—4 ч при 100 000 g. Равновесное положение пероксисом достигается при Ллотности 1,25, интактных хлоропластов — при плотности 1,20—1,22, а митохондрий — при плотности 1,18—1,20. Бо- лее высокая плавучая плотность пероксисом может быть юбусловлена тем, что они частично проницаемы для сахарозы. После центрифугирования градиент делят иа фракции (объемом около 1 мл весь объем стакана обычно составляет [c.416]

Биологические мембраны Структурная организация, функции, модификация физико-химическими агентами (2000) -- [ c.218 ]

Введение в биомембранологию (1990) -- [ c.66 ]

Вирусология Методы (1988) -- [ c.101 , c.102 ]

Методы практической биохимии (1978) -- [ c.48 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология