Разделение молекул по центрифугированием

Удаление молекул из газовых потоков, обсуждавшееся в преды-душей главе, определяется главным образом процессом диффузии. С другой стороны, при удалении частиц гораздо большую роль играют такие процессы, как гравитационное разделение и центрифугирование, перехват и инерционное столкновение, или действие электростатических, термических или магнитных сил. [c.198]

Если газ или пар ввести в быстро вращающийся сосуд, то тяжелые изотопные молекулы будут концентрироваться у стенок сосуда, легкие — в области оси вращения. Теория разделения изотопных молекул методом центрифугирования приводит к следующему выражению для коэфициента разделения [c.44]

Фракционирование белков, нуклеиновых кислот и других макромолекул при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы основано на различии в скорости седиментации молекул, пропорциональной их молекулярной массе. Фракции РНК, обладающие различной молекулярной массой, после центрифугирования распределяются в линейном градиенте концентрации сахарозы при этом благодаря значительной вязкости растворов сахарозы улучшается разделение и уменьшается возможность смешивания различных фракций. [c.172]

Рис. 4.14. Разделение молекул ДНК с различной плотностью посредством центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия. Схематически изображены последова-

Электрофоретическое разделение НЬА и НЬ8 по методу подвижной границы показывает, что разница между зарядами этих молекул составляет один элементарный заряд на половину молекулы. Вполне возможно, что эта разница обусловлена заменой всего лишь одной аминокислоты в а- или р-цепи. Для того чтобы дать точный ответ, нужно было бы иметь данные полного анализа аминокислотной последовательности в обеих цепях. Однако установить участок, в котором два вида молекул гемоглобина различаются по аминокислотному составу, можно и без полного определения последовательности аминокислот. Протео-литический фермент трипсин гидролизует пептидные связи, в образовании которых участвуют карбоксильные группы остатков лизина и аргинина. И лизин, и аргинин имеют сравнительно длинные неразветвленные боковые цепи с положительным зарядом на конце. В каждой половине молекулы гемоглобина на 287 аминокислотных остатков приходится около 26 остатков лизина и аргинина. Таким образом, трипсиновый гидролизат половины молекулы гемоглобина должен содержать около 28 пептидов (поскольку в каждой половине имеются две различные цепочки), каждый из которых содержит в среднем немногим больше 10 остатков. В действительности при таком гидролизе отщепляется устойчивое ядро , содержащее около четверти аминокислотного состава половины молекулы. Анализ состава этого ядра , отделенного центрифугированием от прочих пептидов, показывает, что в НЬА и в НЬЗ оно имеет одинаковый аминокислотный состав и, вероятно, одинаковую последовательность аминокислотных остатков. [c.223]

Оценка чистоты. — Шведские химики Сведберг и Тизелиус внесли большой вклад в развитие химии белка разработкой аналитических методов, чрезвычайно удобных для характеристики этих, высокомолекулярных соединений. Метод ультрацентрифугирования Сведберга служит для определения молекулярного веса. При вращении с очень большой скоростью ячейки, содержащей раствор белка, молекулы белка под действием центробежных сил движутся от центра со-скоростью, зависящей от величины молекулярного веса. Специальная оптическая система дает возможность наблюдать и фотографировать ячейку во время центрифугирования. Молекулярный вес может быть, найден либо из определения седиментационного равновесия, либо по-скорости седиментации- Хотя теоретически первый метод точнее, для достижения равновесия требуется длительное время, и поэтому более точные значения получают, исходя из определения скорости седиментации. При применении ультрацентрифуги можно установить также гомогенность молекул (по величине и форме). Тизелиус предложил (1937) электрофоретический метод разделения молекул белка в электрическом поле молекула белка движется со скоростью, определяющейся величиной молекулы, ее формой, количеством и типом ионизированных групп. Материал, кажущийся гомогенным по растворимости, может содержать компоненты, отличающиеся по электрофоретической подвижности. Жестким критерием чистоты является профиль кривой распределения, получаемой при противоточном распределении молекул (Крейг, см. 31.29). [c.674]

ВЫХ оснований или нуклеотидов, полученных после расщепления полимера (подробнее — см. стр. 58). С нуклеотидным составом ДНК однозначно связаны два физических свойства двухцепочечных комплексов, которые часто используются для характеристики полученных препаратов 2 . 2в Одно из них — так называемая температура плавления Гщ — это температура, при которой происходит распад двухцепочечного комплекса на одноцепочечные молекулы этот процесс легко наблюдать по изменению УФ-поглощения или оптического вращения раствора (подробнее см. в гл. 4). Другая характерная константа ДНК — плавучая плотность р — может быть определена из результатов равновесного ультрацентрифугирования Такое центрифугирование проводят обычно в растворах солей, обладающих высокой плотностью чаще всего применяют хлорид или сульфат цезия. При длительном центрифугировании устанавливается градиент плотности раствора, а ДНК собирается в узкой зоне, где существует равновесие между центробежной силой и выталкивающей силой, которая определяется разностью плотности осаждаемого вещества и применяемого солевого раствора в данной зоне. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности Сз С1 может служить не только аналитическим методом для характеристики препарата ДНК, но и полезным препаративным методом для разделения ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Подобным же образом препаративное ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы используется для разделения молекул ДНК, различающихся по скорости седиментации. [c.31]

В ряде случаев для исследовательских целей и решения производственно-технических задач необходимо полное отделение дисперсной фазы от дисперсионной среды. Такое разделение осуществляют ультрафильтрацией и центрифугированием. Метод ультрафильтрации заключается в фильтровании растворов через особые фильтры, способные пропускать молекулы растворителя и не пропускающие коллоидные частицы и макромолекулы высокомолекулярных соединений. [c.307]

Рассмотрение способов разделения и концентрирования стабильных изотопов позволяет сделать некоторые обобщения. На эффективность разделения, прежде всего, влияет величина коэффициента разделения, который может быть разным при разделении различными методами изотопов одного элемента. Для разделения изотопов легких элементов наиболее эффективны методы фракционной перегонки и изотопного обмена для срединных и тяжелых элементов наибольший эффект дают методы газовой диффузии и центрифугирования, зависящие не от отношения, а от разности масс разделяемых изотопных разновидностей молекул. Для концентрирования весьма важного в промышленном отношении дейтерия наиболее эффективным оказывается электролиз воды. [c.47]

Изложите теорию распределения молекул в гравитационном ноле или в поле центрифуги и проведите приближенные расчеты для определения возможности разделения изотопов с атомными весами 100 и 101 при центрифугировании. [c.329]

Кинетические методы разделения, основанные на различии средней скорости теплового движения молекул с неодинаковой массой, например, важнейшие для практики методы термодиффузии [5, 6] и центрифугирования [7, 8], которые, несмотря на низкий коэффициент однократного разделения (а — 1) или обогаш,ения е = а — (г 1), могут быть масштабированы для достижения достаточно высокой эффективности (рентабельности, производительности и т.д.) в промышленном масштабе [6, 8] [c.357]

Для грубого предварительного разделения клеточных фрагментов достаточно кратковременного последовательного центрифугирования при нескольких разных скоростях (с разным центробежным ускорением) (разд. 3.1. а). Однако, чтобы получить максимально чистые препараты органелл или молекул, используют центрифугирование в градиенте плотности. Например, для разделения РНК на несколько фракций, различающихся по константам седиментации, сначала в пластмассовой центрифужной пробирке создают градиент концентраций раствора сахарозы (от 25% на дне до 5% на поверхности). Затем сверху аккуратно наслаивают препарат РНК и проводят центрифугирование с очень высокой скоростью в течение нескольких часов. Препарат РНК разделяется на ряд медленно седиментирующих резких полос, стабилизируемых градиентом сахарозы. Затем пробирку прокалывают снизу и собирают фракции по каплям в пробирки с помощью коллектора фракций. Далее определяют положеиие каждой фракции и содержание в ней РНК. [c.163]

Центрифугирование. Метод основан на различии гравитационной силы во вращающейся центрифуге, действующей на молекулы с различной массой. Разделяемая смесь подводится к центру ротора центрифуги. Обогащенный продукт отбирается от периферии центрифуги. Коэффициент разделения равен [c.453]

Препараты гликогена полидисперсны. Один такой препарат был разделен на фракции с молекулярным весом, лежащим в пределах 1—14 миллионов. Молекулы имеют несколько удлиненную форму, причем соотношение между осями равно 1 18 (т.е. значительно меньше, чем в случае нитевидной макромолекулы). Электроно-граммы фракции со средним молекулярным весом 1 500 ООО (полученной центрифугированием) указывают на присутствие частиц с диаметрами 50—150 А, что хорошо совпадает с размером 100 А, вычисленным для частиц такого веса в предположении, что они имеют форму куба. Вискозиметрические измерения тоже указывают на почти шарообразное строение частицы гликогена (приблизительно в соответствии с законом Эйнштейна, см. том I), тогда как в случае амилопектина вискозиметрический метод указывает на удлиненную конфигурацию, хотя и в значительно меньшей степени, чем у целлюлозы. [c.317]

Основным условием применимости метода центрифугирования является наличие летучего химического соединения у подвергающегося изотопному разделению элемента. Как и у урана, у некоторых химических элементов существуют летучие фториды (см. табл. 5.8.1). Фтор имеет только один стабильный изотоп, и поэтому его наличие в молекуле не мешает процессу разделения. Инертные газы (криптон и ксенон) непосредственно используются в качестве рабочих газов при центрифугировании. Для разделения изотопов других элементов приходится использовать более сложные соединения, в которых присутствуют изотопы углерода и водорода (металлоорганические соединения), изотопы хлора (хлориды) и др. Наличие балластных изотопов в молекуле рабочего соединения заметно затрудняет процесс разделения на газовых центрифугах. [c.211]

В последнее время разработан метод центрифугирования в градиенте плотности, с успехом использованный для разделения нуклеиновых кислот. По этому методу центрифугируют смешанный раствор высокомолекулярного и низкомолекулярного веществ. При больших угловых скоростях вследствие седиментации низкомолекулярного вещества на разных уровнях устанавливаются различные плотности раствора. Если молекулы высокомолекулярного соединения находятся в точках с плотностью раствора, большей их собственной плотности, то они перемещаются к оси вра- [c.49]

С химической точки зрения гормоны гипофиза представляют собой либо олигопептиды, например окситоцин и вазопрессин, о которых сказано выше, либо полипептиды со сравнительно небольшими молекулами, состоящими из одной полипептидной цепи. Адренокортикотропный гормон (АКТГ), называемый также кортикотро-пином, выделенный из гипофиза свиньи, был разделен в процессе операций очистки хроматографическим путем и другими методами на два компонента — кортикотро-пины А иВ (применяют также обозначения аир). Кортикотропин Р имеет молекулярный вес 4567, установленный методом центрифугирования. При номощи методов, впервые примененных к инсулину, установлено, что препараты А, а и р являются тождественными или очень сходными соединениями, обладающими полипептидной цепью, состоящей из 39 аминокислотных остатков, происходящих из 15 аминокислот, с серином у аминного конца и фенилаланином у карбоксильного конца. Была определена последовательность всех аминокислот, причем найдено, что препараты, выдо-ленные из различных животных, несколько отличаются друг от друга строением определенных участков цепи. Кортикотропин В образуется из кортикотропина А в результате потери 11 аминокислотных остатков от карбоксильного конца таким образом, он содержит в своей цепи всего 28 аминокислот. [c.448]

Важнейшие методы разделения белков, основанные на различии молекул по размеру, — зто диализ, ультрафильтращи, центрифугирование и гель-хроматофафия. С помощью диализа и улыпрафипьтрации [32] отделяют преимущественно низкомолекулярные компоненты от белков. При проведении диализа полупроницаемая мембрана (размер пор 5 — 100 нм) беспрепятственно пропускает воду, небольщие иоиы и молекулы, в то время как крупные молекулы белков задерживаются. Движущей силой процесса разделения является перепад концентраций между раствором и растворителем на мембране. При ультрафильтрации процесс разделения ускоряется путем приложения повышенного давления (0,5 — 10 бар). В качестве мембран чаще всего применяются синтетические материалы на основе производных целлюлозы и полиамида, делающие возможным при различных размерах пор (1 — 10 нм) разделение пептидов, пептидных производных и белков. [c.349]

На рис. 11.6 приведена диаграмма, которая позволяет определить метод фазового разделения или извлечения отдельных компонентов из раствора, если известны размеры взвешенных частиц, растворенных молекул и ионов, входящих в его состав [49]. Так, например, для отделения частиц размером 1—10 мкм от раствора или газа можно использовать гравитационное осаждение, гидроциклонную очистку, центрифугирование, сита и фильтры, а для смесей, состоящих из частиц, соизмеримых с размерами ионов, т. е. для растворов, приемлемыми методами могут быть обратный осмос, диализ и электродиализ, ионный обмен, экстракция и ультрафильтрация. [c.56]

Для того чтобы отделить рибосомы от полисом, был использован метод центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Этот метод позволяет разделять материалы, осаждающиеся с разными скоростями в сильном гравитационном поле, и заключается в следующем. Пластмассовую центрифужную пробирку наполняют раствором сахара, концентрация которого плавно меняется, например от 30% на дне пробирки до 15% в верхнем слое. Для получения градиента медленно наполняют пробирку из двух сосудов, содержащих 15-процентный и 30-процентный раствор сахарозы. По мере наполнения количество приливаемого 30-процентного раствора убавляют, а 15-процентного — прибавляют. Испытуемый материал, состоящий из молекул различной величины, осторожно наслаивается поверх раствора сахара, после чего пробирку помещают в ротор центрифуги. Сахарозный градиент сохраняется во время центрифугирования и после него за счет силы тяжести. Во время центрифугирования молекулы разного размера проходят неодинаковое расстояние и остаются разделенными и после центрифугирования. Дно пластмассовой пробирки можно проколоть и собрать отдельные фракции, а затем их проанализировать. [c.310]

В ряде случаев для исследовательских целей и решения производственно-технических задач необходимо полное отделение дисперсной фазы от дисперсионной среды, а в растворах высокомолекулярных соединений — отделение этого соединения от растворителя. Такое разделение осуществляют ультрафильтрацией и центрифугированием. Метод ультрафильтрации заключается в фильтровании растворов через особые фильтры, способные пропустить молекулы растворителя и не пропускающие коллоидные частицы и макромолекулы высокомолекулярных соединений. [c.305]

Некоторые методы разделения непосредственно основаны на разных массах изотопных молекул, атомов или ионов. К ним относятся электромагнитное разделение в масспектрометрах или аналогичных приборах, разделение путем диффузии и центрифугирования. Более разнообразны и чаще применяются способы разделения, основанные на различиях, в таких свойствах, которые зависят от разных нулевых энергий колебаний как атомных ядер в молекулах, так и самих молекул в кристаллических решетках или жидких телах. Разные нулевые энергии колебаний у изотопов также зависят от разных масс их ядер. [c.64]

Разделение липопротеидов плазмы с помощью ультрацентрифугирования основано на существенном различии в плотности липидов и белков (соответственно 0,88—1,06 и 1,30—1,35). Различные классы липопротеидов плазмы, имеющие разное соотношение липид белок, характеризуются определенными значениями плотностей. Один из вариантов этого метода включает измерение скорости флотации (в единицах Сведберга, 5г) липопротеидов в водной среде данной однородной плотности. Величина 5 зависит от плотности, размера и формы молекулы липопротеида. Липопротеиды наиболее низкой плотности (низкое отношение белок липид) имеют наибольшее значение Другой вариант основан на центрифугировании по градиенту плотности. С этой целью плотность плазмы ступенчато повышают добавлением растворов веществ, не влияющих на ее свойства, в результате чего липопротеиды в процессе ультрацентрифугирования концентрируются в виде полос в тех местах раствора, где его плотность соответствует плотности липопротеида. [c.369]

К молекулярно-кинетическим методам разделения относятся газовая диффузия, центрифугирование, масс-диффузия и термодиффузия. Все перечисленные методы используют различие масс разделяемых изотопов. Для разделения изотопов этими методами необходимо иметь готовое или синтезировать новое газообразное вещество (термодиффузия может проводиться и для жидких смесей), в состав которого входят разделяемые изотопы. Производительность разделительных элементов зависит от давления рабочего соединения, упругость пара которого при комнатной температуре должна быть не менее 5-10 Торр. Кроме того, необходимо, чтобы это соединение было достаточно устойчиво по отношению к температурной диссоциации и коррозионно совместимо с материалами, из которых изготовлены разделительные элементы. Желательно, чтобы содержание разделяемого элемента в молекуле рабочего соединения было также достаточно высоким. [c.127]

Наномним, что нри центрифугировании в сахарозном градиенте разделение основано на различиях в скорости седиментации молекул, а не ни различиях в плавучей плотности. Это означает, что молекулы РНК, ДНК и белка при центрифугировании в сахарозном градиенте никогда не достигнут положения равновесия. Их плотность значительно выше плотности самых концентрированных растворов сахарозы, п при длительном центрифугировании все они оседают на дно центрифужной пробирки. Поэ/ому центрифугирование в сахарозном градиенте не следует путать с центрифуг гированием в градиенте солей цезия, которое широко иснользуется для разделения молекул по их плавучей плотпостп. [c.127]

УЛЬТРАФОСФАТЫ, см. Фосфаты конденсированные. УЛЬТРАЦЕНТРИФУГЙРОВАНИЕ, метод разделения и исследования частиц размером менее 100 нм (коллоидные системы, молекулы белков, неуклеиновых к , синтетич. полимеров) под действием центробежных сил. Подробнее см. Центрифугирование. [c.37]

Пря улыпрацентрифугировании для разделения используется седиментация, зависящая от размера, плотности и формы молекулы белка. Центрифугирование в градиенте плотности (зональное центрифугирование) часто применяется для разделения белков, а также для разделения органелл и вирусов. Одной из характеристик белка служат данные седиментационного анализа в ультрацентрифуге (разд. 3.5.4). Положение возникающих белковых зон можно наблюдать с помощью оптических методов. [c.349]

Для большинства методов этой группы характерно отсутствие четкой границы в приложении к разделению гомогенных и гетерогенных смесей веществ. Например, электрофорез возник и до сих пор иногда рассматривается только как метод разделения коллоидных частмп. Более того, по сути своей — это метод разделения заряженных частиц за счет их различных подвижностей в электрическом поле. В общем случае размеры частиц не оговариваются, и область применения метода охватывает и простые ионы, и макроионы аминокислот, и заряженные частицы коллоидов и взвесей. Аналогично обстоит дело с ультра-центрифугированием и ППФ-методами. Даже в тех случаях, когда метод имеет достаточно четкие границы применимости по размерам или массам разделяемых частиц, их положение на условной щкале дисперсности частиц различной природы не пршязано к принятой границе гомогенности, Существование верхней границы чаще всего определяется принципом целесообразности если задача легко рещается более простым методом, нет необходимости использовать более сложный. Наличие нижней границы может быть связано как с объективными факторами, определяемыми природой явления, используемого для разделения, так и с техническими возможностями практической реализации условий, необходимых для осуществления процесса разделения. Наиболее наглядный пример — ультрацентрифугирование. Очевидно, что с помошью ультрацентрифуги можно выделить взвешенные частицы из раствора, но в этом нет необходимости. А при переходе к разделению частиц на молекулярном уровне в случае жидких фаз возможности метода ограничены фракционированием макромолекул. Добиться, фракционирования простых молекул удается только в газовой фазе, но при ус ювии ра зряжения и чрезвычайно высоких скоростей вращения, реализуемых только при магнитной подвеске ротора центрифуги. [c.242]

В случае высокодиоперсных кремнеземов определение концентрации адсорбированного вещества на поверхности облегчается благодаря особым свойствам образующегося геля, концентрация твердой фазы в котором после центрифугирования составляет 6—7% [9]. В спектре такого геля наблюдается обычно интенсивная полоса поглощения свободных функциональных групп молекул, находящихся в растворе и в адсорбированном состоянии, а также полоса поглощения связанных в результате взаимодействия с поверхностью групп, проявляющаяся в виде плеча полосы поглощения свободных функциональных групп. Выделение полосы поглощения связанных карбонильных групп производится путем исключения поглощения свободных карбонильных групп с помощью кюветы переменной толщины [7, 8] или графическим разделением перекрывающихся полос [53, 54]. Основную ошибку при исследовании суспензии, наряду с неточностью воспроизведения толщины слоя, вносит испарение растворителя вследствие плохой герметичности используемых кювет. В работах [9, 51] использовались стандартные разборные кюветы из комплекта жидкостных кювет спектрометра. Одно из окошек кюветы имело кольцевую канавку глубиной в 1 мм. При наложении второго окошка кюветы избыточное количество геля стекает в эту канавку, что благоприятствует воспроизведению толщины слоя и предотвращает попадание суспензии на прокладку кюветы. Для предотвращения испарения растворителя кювета помещалась также в металлический кожух, внутри которого создавалось давление насыщенного пара растворителя. [c.77]

Центрифугирование было использовано для разделения изотопов углерода (в виде СС14), криптона, ксенона и урана (в виде иг ). Разделение осуществляется за счет различия центробежных сил, действующих на молекулы разных масс. Применяется противоточная газовая центрифуга, в к-рой смесь циркулирует, двигаясь вверх, вдоль оси вращения в центральной части, и вниз — по периферии. Такая центрифуга — аппарат колонного типа с многократным повторением элементарного разделительного эффекта (в каждом поперечном сечении) вдоль направления прямого и возвратного потоков. Коэфф. разделения определяется выражением [c.100]

Приведенная работа Месельсона интересна также тем, что наряду с первым применением на практике принципа ультрацентрифугирования в градиенте плотности оказалась основополагающей для типично биологической проблемы — выяснения механизма воспроизведения (редупликации) молекул дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). В градиенте плотности хлорида цезия авторы проводили центрифугирование смеси молекул ДНК, меченных тяжелым изотопом азота ( К) или 5-бромурацилом, с немечеными молекулами. Вследствие весьма незначительной разницы в плотностях таких молекул возможно разделение меченых и немеченых молекул. Таким образом было показано, что в процессе удвоения количества ДНК у бактериальных клеток кишечной палочки все молекулы ДНК первого поколения клеток оказываются гибридными (содержат равные количества меченого и немеченого материала), во второй же генерации получаются в равных количествах гибридные молекулы и молекулы, не содержащие метки. Позже было показано подобное распределение молекул ДНК и у других размножающихся митозом организмов. В итоге такие данные позволили отвергнуть дисперсный механизм редупликации ДНК и строго доказали наличие двойной структуры молекулы ДНК, воспроизводящейся, вероятно, по полукопсервативпому механизму.— Прим. перев. [c.242]

S и 16S РНК обычно в 6—10 раз превышает ширину полосы, В то же время разделение этих двух РНК центрифугированием в градиенте сахарозы или хроматографией на МАК всегда бывает неполным, поэтому для анализа и (или) очистки требуется добавочное центрифугирование или хроматография. Существенно, что при данной концентрации геля подвижность молекулы РНК обычно линейно зависит от ее молекулярного веса (Lewi ki, Sinskey, 1970). [c.247]

При использовании метода, основанного на измерении скорости седиментации, градиент сахарозы может быть заранее приготовлен с помощью автоматического устройства, создающего градиент. Раствор, содержащий макромолекулярные частицы, осторожно наслаивают сверху. Хотя в результате такого наслаивания в верхней части раствора образуется область отрицательного градиента плотности, слой частиц поддерживается очень сильным положительным градиентом плотности сахарозы, которая препятствует осаждению каиелек жидкости и обеспечивает постоянную скорость миграции крупных молекул. В ходе центрифугирования под действием центробежных сил частицы мигрируют сквозь столбик жидкости и распределяются по дискретным зонам. Каждая зона содержит только молекулы одного типа, движущиеся вдоль градиента с характерной для них скоростью седиментации. По истечении заранее намеченного времени центрифугу останавливают, пробирки вынимают из ротора и тем или иным способом отбирают фракции. Поскольку в данном методе за расположением границ в процессе центрифугирования наблюдать невозможно, приходится действовать вслепую. В связи с этим для определения промежутка времени, оптимального для разделения на фракции, приходится проводить несколько пробных центрифугирований. [c.417]

Эти расчеты можно использовать только как самые предварительные, поскольку сразу же после начала центрифугирования на градиент концентрации образца будут влиять по крайней мере два других фактора. Первый из них выявляется в тот момент, когда молекулы РНК проходят через резко выраженную зону, отделяющую сахарозу основного градиента от сахарозы градиента образца. При этом полоса образца суживается, и концентрация его градиента возрастает. Этот эффект будет выражен в меньшей степени, если концентрация сахарозы в поверхностном слое основного градиента будет выше концентрации сахарозы в нижнем слое градиента образца пе более чем па 1—2%. Второй фактор, влияющий на градиент концентрации образца, обусловлен присутствием в большинстве градиептов разных по величине РНК. Но мере отделения быстро седимен-тирующих РНК от медленно седиментирующих молекул РНК градиент концентрации образца будет уменьшаться. Суммарное влияние этих двух факторов предугадать очень трудно. Кроме того, при попытке использовать максимальную емкость того или иного градиента нужно отдавать себе отчет в том, что всякое увеличение высоты слоя наносимого образца не может не привести к ухудшению разделения РНК. Поэтому общий накопленный опыт, а также индивидуальные эксперименты помогут устано-пить в каждом конкретном случае те необходимые предельно допустимые количества РНК, которые можно наносить па сахарозный градиент. [c.134]

Первый эксперимент с применением метода центрифугирования в градиенте плотности [461] особенно наглядно продемонстрировал значение этого метода. В этом эксперименте бактерии выращивались на среде, богатой № , и поэтому дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) организмов, меченных изотопом тяжелого азота, обладала несколько большей плотностью, чем обычная ДНК. Через определенное время бактерии переносили в среду с обычным распределением изотопа азота и методом центрифугирования в градиенте плотности анализировали изменения плотности ДНК, выделенной из ряда последовательных генераций клеток. На основе предположения Уотсона и Крика [30] было принято, что редупликация ДНК во время деления клеток включает разделение двух цепей двойной спирали (см. стр. 130), причем каждая цепь служит матрицей для синтеза дополняющей ее цепи. Если этот механизм достоверен, то вторая генерация клеток, происходящих от клеток, меченных N , должна содержать ДНК, в которой изотопом тяжелого азота мечена одна из цепей каждой двойной спирали. В последующих генерациях должно возрастать количество ДНК с обычным распределением изотопов азота, однако при этом сохраняется также некоторое количество наполовину меченной ДНК. В любой данный момент времени в растворе должны присутствовать молекулы ДНК только с тремя четко определенными плотностями и никаких компонентов с промежуточной плотностью обнаруживаться не должно. Это предположение было полностью подтверждено данными по ультрацентрифугированию в градиенте плотности (рис. 55), и поэтому механизм редупликации ДНК, который раньше был лишь плодом смелых теоретических представлений, можно считать в настоящее время окончательно установленным. В относительно короткое время после этого классического эксперимента метод центрифугирования в градиенте плотности различными путями способствовал развитию биохимических исследований. Можно привести несколько примеров, иллюстрирующих это положение. Методом меченых атомов, подобным описанному выше, было установлено, что некоторая часть рибонуклеиновой кислоты (РНК) переходит в последующие генерации клеток в нативной форме [468]. Было найдено, что плотность ДНК является линейной функцией содержания гуанина и цитозина в различных микроорганизмах, и, таким образом, ДНК, выделенная из какого-либо вещества, образует в градиенте плотности полосу с характерным расположением [469, 470]. На диаграмме градиента плотности ДНК, полученной из тканей высших организмов, периодически обнаруживаются сателлит-ные полосы [471], которые могут быть обусловлены симбиозными организмами или другими, еще неизвестными причинами. Типичный пример этого эффекта изображен на рис. 56, который, между прочим, наглядно свидетельствует также о чувствительности метода обнаружения малых [c.165]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология