Вирус центрифугирование в градиенте плотности

Рис. 9,3. Центрифугирование в градиенте плотности экстракта клеток, инфицированных аденовирусом. Полоса, содержащая вирус, указана стрелкой

Очистка вируса центрифугированием в градиенте плотности [c.186]

Препараты пикорнавирусов, полученные из культур тканей, контаминированы клеточными компонентами, в том числе мембранами, и если вирус предполагается использовать для антигенного или биохимического анализа, его необходимо очистить. При этом, как правило, используют тот или иной метод центрифугирования в градиенте плотности. Если работа ведется со значительными количествами вируса, очистке обычно предшествует концентрирование, например осаждение вируса сульфатом [c.57]

Этот метод нашел особенно широкое применение при разделении вирусов с различным содержанием нуклеиновых кислот, а также при изучении свойств нуклеиновых кислот (см. гл. IV, разд. В). Центрифугирование В градиенте плотности оказалось весьма ценным методом очистки и разделения некоторых вирусов. [c.37]

Осадок полностью ресуспендируют и наносят на градиент плотности s l (I ч). Проводят равновесное центрифугирование вируса в градиенте плотности s l (2 ч). Извлекают зоны вируса и разбавляют 50 мМ трис-НС1, pH 8,0 (3 мин). Вирус концентрируют ультрацентрифугированием, ресуспендируют в трис-буфере и измеряют Егео (30 мин). [c.208]

Обычно пикорнавирусы очищают центрифугированием в градиенте плотности (хотя применялась и гель-фильтрация, в том числе в промышленных масштабах), В связи с малыми размерами пикорнавирусы имеют коэффициент седиментации 150— 160 5, меньший, чем у большинства других вирусов. Однако благодаря отсутствию липидов и исключительно компактной структуре они имеют высокую плавучую плотность (около 1,34 г/см в градиенте плотности хлористого цезия однако см. ниже разд. 5.3.3). В градиентах концентрации сахарозы такая плотность не достигается. Поэтому при очистке применяется разделение в сахарозных градиентах по скорости седиментации или разделение по плавучей плотности в градиентах хлорида или сульфата цезия. [c.59]

При выделении вирусов из таких тканевых экстрактов наилучшие результаты дают следующие методы а) дифференциальное центрифугирование б) осаждение сульфатом аммония в) центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы г) центрифугирование в градиенте плотности СвС д) экстракция растворителями и нротиво-точное распределение между частицами растворенного полимера и е) обработка ферментами [469, 470]. [c.35]

Перед вторым центрифугированием в градиенте плотности тартрата калия вирус либо разводят в равном объеме NTE, либо предварительно переосаждают центрифугированием 30 мин при 200 ООО g и 4°С и затем уже разводят в небольшом объеме NTE. [c.186]

Двухцепочечный комплекс, построенный из исходной (- -)-цепи вирусной РНК и комплементарной к ней (—)-цепи РНК, синтезирующейся в организме хозяина при вирусной инфекции, является промежуточным продуктом при воспроизведении вируса в клетке ( репликативная форма ). Для такого комплекса характерна устойчивость к действию небольших концентраций РНК-азы, он может быть выделен и отделен от других форм РНК с помощью центрифугирования в градиенте плотности или хроматографии на МАК (см., например,121). [c.37]

Для очистки аденовирусов обычно используют комбинированный метод, состоящий из экстракции вируса из клетки дезоксихолатом натрия, обработки нуклеазами и фреоном 113 и равновесного центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия [855], Иногда применяют метод изоэлектрической преципитации, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе и сефадексе Г 200 и метод двухфазных полимерных систем. При дифференциальном центрифугировании происходят большие потери вируса, по-видимому, вследствие его агрегации. [c.11]

Такие роторы находят большое промышленное применение. Так, с помощью роторов типа К можно выделить препараты вируса гриппа, в 10 раз превосходящие по степени очистки те препараты вируса, которые удавалось выделить применением обычного центрифугирования. В роторе Андерсона производится и разделение по плотности. При этом для образования градиентов плотности используют либо растворы сахарозы, либо в титановых роторах растворы хлористого цезия. [c.189]

Наиболее приемлемым методом очистки вирусов этой группы является центрифугирование в градиенте плотности сахарозы и цитрата калия. Применявшиеся ранее такие методы, как дифференциальное центрифугирование, [c.12]

Если требуется определить абсолютную величину плавучей плотности вируса, то используют центрифугирование в самоустанавливающемся градиенте плотности в ана литической центрифуге в присутствии маркера — вещества, плотность которого известна заранее. Этим методом можно получить значение плавучей плотности с точностью до 0,001 г/мл. Обычно время достижения полного равновесия составляет от 24 до 60 часов при 37 ООО об/мин и температуре 20"". [c.63]

Было проведено сравнительное изучение седиментационных свойств РНК вируса саркомы Рауса и седимеп-тационных свойств РНК других вирусов. Наряду с центрифугированием в градиенте плотности глицерина после обработки диметилсульфоксидом или после нагревания была использована и новая методика — непосредственная обработка 99%-ным раствором диметилсульфоксида, которая гарантирует полную денатурацию нуклеиновых кислот и, таким образом, дает возможность выявить такие разрывы цепей и более длинные пропуски которые [c.114]

Для создания преформированного градиента сахарозы пользуются специальными устройствами (см. раздел Градиентные и фракционирующие приборы ). Для центрифугирования вирусов обычно применяют градиент плотности сахарозы 20—60%. Исходные растворы сахарозы (20% и 60%) готовят на каком-либо буфере, обычно СТЕ, pH 7,4. Если объем центрифужной пробирки 20— 30 мл, то на созданный градиент можно нанести сверху 1—2 мл очищенной и концентрированной вируссодержащей суспензии (до 5—10 мг вируса). Количество наносимого вируса может варьировать для каждого типа вируса. [c.60]

Бракк (Вгакке) использовал центрифугирование в градиенте плотности сахарозы для очистки вирусов растений [c.211]

Методы с использованием хлористого цезия требуют существенных материальных затрат, но позволяют получить высокоочищенный вирус и работать с большими объемами образцов как в случае преформированного, так и формирующегося по ходу центрифугирования градиента. Использование ДДС-Na в качестве детергента не рекомендуется, так как додецилсульфат цезия нерастворим. Существенный недостаток градиентов хлористого цезия помимо высокой стоимости этой соли состоит в том, что в них может происходить модификация вирусов. В частности, имеются данные, что риновирусы могут поглощать ионы цезия и в результате приобретать аномально высокую плотность (1,4 г/мл вместо 1,34 г/мл, обычной для пикорнавирусов) [19]. Аналогичное явление описано и для полиовируса. [c.62]

Второй метод очистки вируса центрифугированием в градиенте представляет собой упрощенный вариант метода Смита и др. [5]. В этом случае опускают стадию центрифугирования в градиенте концентрации сахарозы, на которой не достигается существенной очистки вируса, а вирус фракционируют непосредственно в преформированном градиенте плотности s l. [c.206]

Данный метод очистки пикорнавирусов в градиентах концентрации сахарозы не требует много времени и существенных материальных затрат и мало сказывается на свойствах вирусов (см. ниже). Однако при этом препараты вирусов могут содержать некоторые контаминанты. Если требуется исключительно высокая степень очистки, может возникнуть необходимость в дополнительном центрифугировании в градиенте плотности хлористого цезия. Как правило, это необязательно можно осадить вирус для удаления сахарозы (разд. 5.2.3). [c.61]

Материал, полученный одним из описанных выше методов, обычно контаминирован клеточными компонентами. Однако в тех случаях, когда высокая степень очистки не обязательна (например, для постановки RIA или ELISA), его можно использовать уже на этой стадии. Тем не менее для большинства исследований необходима дальнейшая очистка вируса с помощью зонально-скоростного или изопикнического центрифугирования в градиенте. При скоростном центрифугировании положение вируса в градиенте определяется его коэффициентом седиментации, а при изопикническом — плавучей плотностью. Для достижения максимальной степени очистки вирусных частиц от примесей изменение концентрации образующего градиент вещества должно быть плавным в то же время на промежуточных стадиях очистки нередко используют ступенчатые градиенты. В некоторых случаях принципы скоростного и изопикнического центрифугирования совмещаются примером может служить использование градиентов глицерина — тартрата калия [14]. В таких градиентах концентрация тартрата калия возрастает в направлении дна пробирки, достигая плотности, соответствующей плавучей плотности вируса концентрация глицерина, наоборот, максимальна на мениске, что препятствует продвижению медленно седиментирующего материала в направлении дна. Все типы градиентов обычно центрифугируют в бакет-роторах, но в случае изопикнических градиентов такие же или даже лучшие результаты можно получить в угловых или вертикальных роторах с помощью приспособлений для медленного разгона и остановки, обеспечивающих переориентацию градиента без перемешивания. При очистке конкретного вируса часто приходится проводить целую серию последовательных стадий центрифугирования в разных типах градиентов, чтобы добиться нужной степени очистки. [c.100]

Разработаны многочисленные методы очистки вирусов гриппа из аллантоисной жидкости или из культуральной среды. Выбор конкретного метода определяется требуемой степенью чистоты. Чистоту полученного вируса можно установить с помощью электрофореза вирионных белков в полиакриламидном геле (рис. 6.5), но, как и в случае всех оболочечных вирусов, почкующихся через плазматическую мембрану, даже при самой тщательной очистке невозможно избежать контаминации вируса клеточными белками. Кроме того, вирус может быть плео-морфным, что осложняет его очистку центрифугированием в градиентах плотности. Тем не менее при работе с вирусами, дающими высокий титр в культуре клеток или куриных эмбрионах, удается получить препараты, степень контаминации которых клеточными белками незначительна. На первой стадии очистки из содержащей вирус аллантоисной жидкости или культуральной среды удаляют клеточный дебрис с помощью низкоскоростного центрифугирования (10 мин при 2000—10 000 д). Все стадии следует проводить при 0°С, чтобы свести к минимуму потери инфекционности и протеолиз вирионных белков. [c.181]

Обнаружение специфических IgM к вирусу краснухи имеет важное значение при постановке диагноза первичной и врожденной инфекций. Существует множество методов определения и идентификации таких антител. В основе ранее применяемых методов лежит разделение сывороточных IgG и IgM гель-фильтрацией или центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Полученные фракции тестируют в РТГА на присутствие специфических иммуноглобулинов. В последнее время эти методы заменены чисто иммунологическими методами, которые не требуют фракционирования сыворотки. Существуют два основных варианта этих методов. Первый предполагает идентификацию иммобилизованного антигена. При этом антиген вируса краснухи связывают с поверхностью пластика (например, дном лунки 96-луночного планшета), инкубируют его с сывороткой пациентов, а затем с меченными антителами против IgM человека, содержащихся в исследуемой сыворотке. Если после [c.327]

Потенциально фоточувствительные вирусы, такие, как миксовирусы, нужно защищать от света. Что касается рН-стабильности, то вирусы обычно наиболее стабильны от слабощелочных значений pH до их изоэлектрических точек. Для большинства вирусов наиболее оптимальны значения pH 6,7—7,6, Следует также избегать образования пены и гидродинамических воздействий, особенно в случае высокоочищенных препаратов вирусов. При длительных процедурах очистки, таких, как электрофорез и равновесное центрифугирование в градиенте плотности солей тяжелых металлов, необходимо к вирусной суспензии добавлять стабилизирующие коллоиды. Обычно добавляют очищенный альбумин сыворотки крови до концентрации 0,02% [272, 520] иди обезжиренную и лишенную комплемента сыворотку крови в концентрации 0,2% [268]. Также нужно избегать неблагоприятной концентрации ионов в окружающей вирус среде. Чтобы не произошла преципитация вируса, буферный раствор должен иметь значение pH, достаточно отличающееся от его изоэлектрической точки. На первых стадиях очистки нужно использовать буферы очень слабой ионной силы. Например, 0,01 М фосфатный буфер и 0,01 М цистеин при pH 7,0 более выгоден, чем буферы с высокой ионной силой. При работе с лабильными вирусами (вирус саркомы Рауса) хорошие результаты дает применение 0,02 М цитратного натриевого буфера (pH 6,7). В процессе очистки должна быть совершенно исключена бактериальная и грибковая контаминация при помощи тщательной стерильной обработки Это особенно важно, когда процесс концентрирования и очистки контролируется биологическим титрованием. Между отдельными стадиями очистки рост бактерий можно задержать снижением температуры, добавлением антибиотиков (100— 200 Ед/мл) или органических растворителей, например хлороформа в низких концентрациях. [c.30]

Дальнейщую очистку вируса проводят повторным центрифугированием в градиенте. Применяют либо зональное центрифугирование в 15—60%-НОМ градиенте концентрации сахарозы, либо, предпочтительно, изопикническое центрифугирование в 20—45%-НОМ (вес на объем) градиенте плотности тартрата калия. [c.186]

При серийном пассировании вируса в культуре ткани появляются делеционные мутанты [209, 251, 284а]. Обычно делеции затрагивают один, реже — несколько сегментов геномной РНК реовируса. Чаще всего затрагивается сегмент Ы. Нередки и делеции сегментов ЬЗ и М1. Для размножения делеционных мутантов необходим вирус-помощник. Разработана техника выделения относительно чистых фракций делеционных мутантов из препаратов вируса, основанная на центрифугировании в градиенте плотности [5]. [c.324]

Предложено два альтернативных метода очистки вируса. Стандартный метод Смита и др. [5] включает стадии зонального центрифугирования вируса в градиенте концентрации сахарозы я последующего изопикнического центрифугирования в градиенте плотности s l. [c.206]

Рис. 8. Равновесное центрифугирование вируса ЗУ 40 в градиенте плотности СзС1.

Пря улыпрацентрифугировании для разделения используется седиментация, зависящая от размера, плотности и формы молекулы белка. Центрифугирование в градиенте плотности (зональное центрифугирование) часто применяется для разделения белков, а также для разделения органелл и вирусов. Одной из характеристик белка служат данные седиментационного анализа в ультрацентрифуге (разд. 3.5.4). Положение возникающих белковых зон можно наблюдать с помощью оптических методов. [c.349]

Из клеток, зараженных фагом ФХ174, наряду с одноцепочечной ДНК, присутствующей в вирусных частицах, можно с помощью центрифугирования в градиенте плотности и хроматографией на МАК получить двухцепочечный комплекс ДНК с вдвое большим молекулярным весом зэ — так называемую репликативную форму ДНК фага ФХ174. Присутствие в зараженной вирусом клетке форм вирусной ДНК, отличающихся по своей структуре от ДНК вирусных частиц, показано и для многих других вирусов. [c.32]

Обычно для иммунологических исследований (например, ELISA) или иммунизации животных мы выделяем MV из культуральной среды, как описано выше для ВПГ. Однако для анализа спектров вирусных белков и т. д. специалисты рекомендуют использовать метод доктора В. Гибсона, который приводится ниже. Исходным материалом для получения вирусных препаратов максимальной инфекционности и наибольшей чистоты должна быть культуральная среда. Для сохранения высокой инфекционности препарата и целостности вирусных частиц следует избегать осаждения вируса. Впервые центрифугирование в отрицательном градиенте вязкости и положительном градиенте плотности, предложенное Барзилаи и др. [29] для выделения MV, было применено Тэлботом и Алмейдиа [30]. Метод надежен и гарантирует высокую эффективность. Его осуществляют следующим образом [c.291]

Очистку вирусов этой группы обычно проводят осаждением сульфатом аммония или метанолом, обработкой нуклеазами, органическими растворителями и центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия. Из зараженной клетки вирус можно извлекать рецепторраз-рушающим энзимом и дезоксихолатом натрия, [c.10]

Метод дифференциального центрифугирования для конденз ри рования и частичной очистки вирусных препаратов используется уже 30 лет. Недостатки этого метода были устранены Брекком [216], который ввел в 1951 г. метод зонального центрифугирования в градиенте сахарозы. В 1957 г. Мезельсон, Сталь и Виноград [565] разработали метод равновесного дентрифугарования в градиенте плотности, В настоящее время эти два метода являются наиболее совершенными методами очистки и фракционирования вирусов. [c.44]

Ультрацентрифугирование, по-видимому, самый расирост-раненный метод концентрирования, очистки и фракционирования вирусов. Превосходные препаративные ультра-центрифуги позволяют обрабатывать большие количества материала при низкой температуре. Этот метод относительно безвреден для многих вирусов, и его принципы хорошо изучены. Широко применяются оба метода — дифференциальное центрифугирование и центрифугирование в градиенте плотности. [c.55]

Здесь молекулярная масса фракционируемой ДНК доходила до 500 млн. (ДНК вируса G из Вас. megatherium, выделенная обработкой вируса горячим саркозилом с последующей очисткой центрифугированием в градиенте плотности раствора s l). Подробно описаны предосторожности, необхо имые при манипуляциях с такой ДНК во избежание ее разрыва под действием гидродинамических сил. [c.122]