Длительность равновесного центрифугирования

Для одновременного проведения сразу нескольких опытов служат роторы с несколькими ячейками. Используя в ячейках клиновидные кварцевые стекла, можно получить одновременно несколько различных интерференционных картин выше и ниже обычного положения, как показано на фиг. 14. Длительное равновесное центрифугирование в таком роторе с применением оптики Рэлея эквивалентно пяти отдельным опытам с обычным ротором. При работе с такими ячейками, однако, фазовую пластинку необходимо убрать и после этого вновь сфокусировать изображение объективом. [c.54]

Эксперименты по равновесному центрифугированию довольно длительны (их продолжительность может достигать нескольких суток). Исходя из того, что время, необходимое для достижения равновесия, пропорционально квадрату высоты слоя жидкости, определение молекулярных масс по уравнению (УП.44) проводят по высоте слоя в несколько миллиметров. [c.157]

ВЫХ оснований или нуклеотидов, полученных после расщепления полимера (подробнее — см. стр. 58). С нуклеотидным составом ДНК однозначно связаны два физических свойства двухцепочечных комплексов, которые часто используются для характеристики полученных препаратов 2 . 2в Одно из них — так называемая температура плавления Гщ — это температура, при которой происходит распад двухцепочечного комплекса на одноцепочечные молекулы этот процесс легко наблюдать по изменению УФ-поглощения или оптического вращения раствора (подробнее см. в гл. 4). Другая характерная константа ДНК — плавучая плотность р — может быть определена из результатов равновесного ультрацентрифугирования Такое центрифугирование проводят обычно в растворах солей, обладающих высокой плотностью чаще всего применяют хлорид или сульфат цезия. При длительном центрифугировании устанавливается градиент плотности раствора, а ДНК собирается в узкой зоне, где существует равновесие между центробежной силой и выталкивающей силой, которая определяется разностью плотности осаждаемого вещества и применяемого солевого раствора в данной зоне. Равновесное центрифугирование в градиенте плотности Сз С1 может служить не только аналитическим методом для характеристики препарата ДНК, но и полезным препаративным методом для разделения ДНК, различающихся по нуклеотидному составу. Подобным же образом препаративное ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы используется для разделения молекул ДНК, различающихся по скорости седиментации. [c.31]

Одной из основных причин редкого использования метода равновесного центрифугирования сразу же после его разработки Сведбергом являлось чрезвычайно длительное время, необходимое для удовлетвори- [c.162]

Рассмотрение принципов, лежащих в основе равновесного распределения в гравитационном поле, привело Сведберга к убеждению, что этот метод можно использовать для определения молекулярного веса макромолекул, если бы экспериментатор имел в своем распоряжении гравитационные поля порядка 10 —10 д. Создание таких полей стало возможным после разработки в Упсальской лаборатории ультрацентрифуги, и к 1926 г. она была использована для определения молекулярного веса гемоглобина [446, 447] и яичного белка [448]. Популярность этого метода в течение двух следующих десятилетий медленно снижалась в основном вследствие того, что для достаточно близкого приближения к равновесным условиям необходимо длительное время. Однако в последние годы значение равновесного центрифугирования опять повысилось благодаря нескольким факторам. Ряд усовершенствований конструкции прибора и экспериментальных методов привел к значительному расширению применения этого метода для прецизионных измерений [449, 450]. Полагали, что использование 0-растворителей позволит надежно оценить всю функцию распределения по молекулярным весам образцов полидисперсных полимеров по сравнению с ограниченной характеристикой средних значений молекулярного веса таких материалов другими методами. В то же время были разработаны конструкции кювет и экспериментальные методы, которые позволили производить наблюдения за столбиками жидкости высотой 1 мм или менее, что сократило время, необходимое для близкого приближения к равновесию, от нескольких суток до 1 час [451, 452]. Наконец, разработка метода центрифугирования в градиенте плотности позволила исследовать распределение по химическому составу этот способ нашел эффективное применение для изучения биологически важных макромолекул и обещает приобрести равное значение при исследовании синтетических полимеров. [c.157]

Прн рассмотрении положительных и отрицательных особенностей метода осаждения при подготовке проб для спектрального анализа необходимо отметить, что в большинстве случаев равновесное состояние (кристаллизация осадка) достигается довольно медленно. Кроме того, при необходимости пользоваться большими рабочими объемами оказывается затруднительным интенсифицировать эти процессы применением центрифугирования осадков. При работе с концентрированными растворами (т. е. при малых рабочих объемах) часто имеет место неполное осаждение микрокомпонентов и большую роль играет явление соосаждения. Эти обстоятельства приводят к длительной процедуре и значительному увеличению времени, необходимого для подготовки пробы к анализу. [c.436]

Как уже указывалось, при длительном центрифугировании достигается равновесное содержание жидкой фазы. [c.302]

Используя соответствующую соль, можно создать устойчивый в условиях центрифугирования градиент ее концентрации, а тем самым и градиент плотности растворителя. Если природа соли и распределение ее концентрации таковы, что плавучая плотность биополимера выше, чем плотность растворителя на мениске, но ниже, чем у дна пробирки, то по мере перемещения к дну пробирки биополимер достигнет участка, где множитель 1 - / о/р станет равным нулю и дальнейшая седиментация прекратится, т.е. возникнет устойчивая зона нахождения биополимера. Наиболее широкое применение для этой цели нашли растворы солей цезия, которые позволяют получить растворы с плотностью, достаточной для остановки перемещения нуклеиновых кислот. Эксперименты подобного рода весьма дороги, так как требуют длительной, обычно на протяжении нескольких суток, работы ультрацентрифуг. Однако они открывают некоторые уникальные возможности. Например, удается разделить биополимеры, различающиеся лишь изотопным составом. Молекулы ДНК из одного вида микроорганизма, выращенные на средах, содержащих в качестве источника азота соли аммония и 15NH4, не отличаются по объему, но имеют разные массы и, следовательно, различные плавучие плотности. Поэтому при равновесном центрифугировании и градиенте плотности хлорида цезия они образуют отдельные зоны. Пример применения этого метода для доказательства полуконсервативного характера репликации ДНК приведен в 5.1. [c.244]

Сопоставляя данные по плавучим плотностям со значениями плотности растворов метризамида, легко видеть, что плавучие плотности всех перечисленных биологических объектов перекрываются относительно умеренными концентрациями водных растворов метризамида. Вместе с тем высокая плотность самого метризамида (2,17 г/см — за счет трех атомов йода) придает ему способность, подобно s l или KI. образовывать градиент плотности при длительном центрифугировании и большой скорости вращения ротора. Отсюда вытекает возможность использования водных растворов метризамида в качестве среды для равновесного центрифугирования в градиентах плотности. Малая плавучая плотность биополимеров в растворах метризамида, его химическая инертность и отсутствие диссоциирующего воздействия дают ему преимущества по сравнению с солевыми растворами. [c.271]

Потенциально фоточувствительные вирусы, такие, как миксовирусы, нужно защищать от света. Что касается рН-стабильности, то вирусы обычно наиболее стабильны от слабощелочных значений pH до их изоэлектрических точек. Для большинства вирусов наиболее оптимальны значения pH 6,7—7,6, Следует также избегать образования пены и гидродинамических воздействий, особенно в случае высокоочищенных препаратов вирусов. При длительных процедурах очистки, таких, как электрофорез и равновесное центрифугирование в градиенте плотности солей тяжелых металлов, необходимо к вирусной суспензии добавлять стабилизирующие коллоиды. Обычно добавляют очищенный альбумин сыворотки крови до концентрации 0,02% [272, 520] иди обезжиренную и лишенную комплемента сыворотку крови в концентрации 0,2% [268]. Также нужно избегать неблагоприятной концентрации ионов в окружающей вирус среде. Чтобы не произошла преципитация вируса, буферный раствор должен иметь значение pH, достаточно отличающееся от его изоэлектрической точки. На первых стадиях очистки нужно использовать буферы очень слабой ионной силы. Например, 0,01 М фосфатный буфер и 0,01 М цистеин при pH 7,0 более выгоден, чем буферы с высокой ионной силой. При работе с лабильными вирусами (вирус саркомы Рауса) хорошие результаты дает применение 0,02 М цитратного натриевого буфера (pH 6,7). В процессе очистки должна быть совершенно исключена бактериальная и грибковая контаминация при помощи тщательной стерильной обработки Это особенно важно, когда процесс концентрирования и очистки контролируется биологическим титрованием. Между отдельными стадиями очистки рост бактерий можно задержать снижением температуры, добавлением антибиотиков (100— 200 Ед/мл) или органических растворителей, например хлороформа в низких концентрациях. [c.30]

Общие замечания [53, 54]. Большинство видов нативной ДНК являются малопригодными объектами для изучения методами равновесного ультрацентрифугирования из-за их высокого молекулярного веса и низких коэффициентов диффузии. Оказалось, что очень длительное центрифугирование и (или) низкие скорости вращения ротора совершенно неприемлемы для ДНК. Однако для ДНК с небольшим молекулярным весом этот метод в принципе может быть использован. Один из таких образцов (ДНК, дегра,дированная нод действием кислоты до молекулярного веса 25 ООО) был изучен методом Арчибальда [114]. [c.240]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология