Осаждение белков органическими растворителями

Интересно, что процесс денатурации белков, вызванный всеми перечисленными органическими веществами, не зависит от температуры и, для мочевины например, может иметь отрицательный температурный коэффициент. Этим они существенно отличаются от органических растворителей — таких, как, например, спирт или ацетон. Последние денатурируют и необратимо осаждают белок из растворов при комнатной и более высоких температурах. При критической температуре, лежащей около 65°, осаждение белка происходит при относительно невысоких концентрациях органических растворителей. Тем не менее, как уже указывалось в гл. I, нри температурах, близких к точке замерзания, можно производить фракционирование белков добавлением различных количеств растворителей, не вызывая их денатурации. Полагают, что осаждающее и денатурирующее [c.185]

Разделение с помощью органических растворителей. Белки можно фракционировать с помощью осал дения органическими растворителями, например этанолом, ацетоном. Белки, склонные к агрегации, осаждают сульфатом аммония в присутствии нро-нанола [51]. Органические растворители снижают раствори-люсть белков благодаря изменению диэлектрической проницаемости среды. Поскольку причина осаждения состоит в агрегации молекул вследствие электростатического взаимодействия, что аналогично осаждению в изоэлектрической точке, pH в данном случае более важный фактор, чем при осал<дении солями. Следовательно, с помощью органических растворителей можно разделить очень близкие в структурном отношении белки, имеющие разные изоэлектрические точки. Например, при pH 6,5 парваль-бумины II, III и IV были разделены путем осаждения ацетоном [163]. Белок IV выпадал в осадок при концентрации ацетона 55—60%, белки III и IV — при концентрации 60—65%, белки III и II — при концентрации 65—70%, наиболее кислотные ком-коненты смеси с изоточками р/( —4 выпадали в осадок при концентрации ацетона 70—80%. [c.50]

Белки агрегируют без денатурации не только под действием солей и органических растворителей. Полсон и др. [32] иссле-довали способность различных высокомолекулярных нейтралЬ ных водорастворимых полимеров осаждать белки плазмы. Хотя некоторые из них эффективно осаждали белки, высокая вязкость растворов полимеров препятствует их практическому использованию. Единственным исключением является полиэтилен-гликоль различной степени полимеризации. Растворы этого полимера при концентрации до 20% (вес/объем) имеют не очень большую вязкость, и многие компоненты плазмы осаждаются полиэтиленгликолем до того, как его концентрация достигает 207о (вес/объем). Наиболее эффективным является полиэтиленгликоль с мол. массой 4000 и выше для осаждения белков обычно используют полиэтиленгликоль двух типов — с мол. массами около 6000 и 20000. Поведение белков в растворах полиэтиленгликоля довольно сходно с их поведением в процессе осаждения органическими растворителями. Действительно, молекулу полиэтиленгликоля (ПЭГ) можно рассматривать как полимерный органический растворитель, хотя для получения нужной степени осаждения требуются более низкие его концентрации. При добавлении ПЭГ первым из плазмы выпадает в осадок фибриноген — довольно крупный белок, имеющий сильно асимметричные молекулы и обладающий наименьшей растворимостью в плазме. Затем (при нейтральном pH, близком к изоэлектрической точке) осаждаются у-глобулины, а вслед за ними и другие компоненты. Как и в органических растворителях, растворимость белков в растворах ПЭГ возрастает по мере удаления pH от их изоэлектрической точки. [c.81]

Белки, осаждение — потеря белком растюримости, происходящая в результате сближения отдельных могГекул, потери стабилизации, их взаимодействия в образованием надмолекулярных агрегатов, теряющих способность находиться в растворенном состоянии. Белок осаждается при повышении температуры до 45—50 С( при действии ионов тяжелых металлов, органических растворителей, кислот, солей. Дестабилизация белковых молекул является результатом влияний, меняющих варяженность поверхностных групп, разрушающих гидратную оболочку, что в целом и снижает гидро-фильность молекул. Осаждение белка может быть обратимым. [c.14]

Из органических соединений, помимо давно применяемых водных растворов глицерина, широко используют (особенно для солюбилизации) слабые растворы сахарозы. На растворимость белков при экстракции большое влияние оказывает pH среды, поэтому в белковой химии применяют фосфатные, цитратные, боратные буферные смеси со значениями pH от кислых до слабощелочных, которые способствуют как растворению, так и стабилизации белков. Особенно широкое распространение получили трис-буферные системы, представляющие собой смеси 0,2 М раствора трис-(оксиметил)-аминометана (НОСН,)зСКН, (сокращенно обозначают трис ) с 0,1 М раствором хлороводородной кислоты в разных соотношениях. Для выделения белков сыворотки крови используют способы их осаждения этанолом (см. метод Кона), ацетоном, бутанолом и 1гх комбинации. Почти все органические растворители разрывают белок-липидные связи, способствуя лучшей экстракции белков. [c.24]

Высаливание. Растворы нейтральных солей широко используются не только для повышения растворимости белка, но и для избирательного осаждения разных белков, т. е. их фракционирования. Процесс осаждения белков нейтральными солями называется высаливанием. Характерной особенностью белков, осажденных в процессе высаливания, является то, что после удаления соли они сохраняют свои нативные биологические свойства. Сушность процесса высаливания заключается в том, что ионы забирают на себя гидратную оболочку белка, одновременно нейтрализуя заряд белковой молекулы. Способность к высаливанию наиболее ярко выражена у многозарядных анионов, в частности у сульфатов. На практике для высаливания чаше всего применяют сульфаты натрия и аммония. Помимо солей для осаждения белков могут быть использованы органические водоотнимаюшие (гидрофильные) растворители — этанол, ацетон, метанол и др. Высаливание достаточно широко применяется для разделения и очистки белков. Для каждого белка существует своя зона высаливания, т. е. диапазон концентраций соли, позволяющий дегидратировать и осадить белок. После удаления высаливающего агента белок сохраняет все свои природные свойства и функции. [c.72]

Как правило, чем ниже молекулярная масса белка, тем вьние концентрация органического растворителя, необходимая для его осаждения. Если концентрация растворителя слишком велика, осаждение может быть затруднено из-за белок-белкового взаимодействия. В этом случае в раствор добавляют биполярные вещества, например глицин, которые выполняют роль буфера и стабилизируют диэлектрическую проницаемость. Если белок денатурирует при комнатной температуре, осаждение проводят при пониженной температуре (при 0°С). Прибавление к раствору белка органического растворителя вначале вызывает постепенное повышение температуры (до достижения 207о-ной (об./об.) концентрации), иногда уменьшение объема. Важно в процессе осаждения поддерживать постоянную температуру раствора, поскольку растворимость белков сильно снижается при охлаждении. [c.50]

Для концентрирования белков из разбавленных растворов применяется осаждение солями, кислотами и органическими растворителями (ацетон, метанол), ультрафильтрация, диализ, выпаривание, лиофилизация. Осуществлять эти операции тем сложнее, чем меньшее количество белка находится в растворе, например трихлороуксусная кислота не осаждает белок при его содержании 1—25 мкг [17]. [c.246]