Ферменты осаждение органическими растворителями

Химики изучили несколько путей для преодоления указанного недостатка. Одним из перспективных направлений оказалось нековалентное связывание поверхности нанотрубок с макромолекулами. Найдено, что обработка синтетическими полимерами сообщает нанотрубкам растворимость в органических растворителях и заметно меняет их химические свойства. А обработка нанотрубок одним из природных полимеров - крахмалом (а точнее, его комплексом с иодом) - позволяет получать нанотрубки (как и фуллерены), растворимые воде. Такие растворы стабильны в течение нескольких недель. Добавление в раствор амилоглюкозидазы -фермента, гидролизующего крахмал, - ведет к осаждению нанотрубок уже через 10 мин. [c.409]

При рациональном использовании культуральной жидкости после отделения мицелия из нее можно получить препараты гидролитических ферментов, например путем осаждения органическими растворителями. В состав таких ферментных препаратов входят пектиназа, целлюлаза, амилаза, и они могут быть использованы для приготовления соков и вина. [c.118]

Для очистки ферментов применяют осаждение их из водных растворов органическими растворителями такими, как метиловый, этиловый, изопропиловый спирты, ацетон высаливание сульфатами аммония, натрия, цинка, хлоридом натрия фракционирование. Высушивание предварительно очищенных и сконцентрированных препаратов осуществляют в распылительных сушилках или методом сублимации. [c.89]

Так как для осаждения ферментов применяются органические растворители, которые необходимо регенерировать, то остановимся на основных полол<ениях их перегонки. [c.140]

После осаждения ферментов сернокислым аммонием электродиализ не следует применять, так как происходит значительное снижение pH, что может привести к инактивации ферментов. Повышение pH экстракта ферментов до 8,2—8,6 вызывает образование изоэлектрического состояния многих неактивных белковых соединений, уменьшающее устойчивость с последующим выпадением их в осадок, что повышает степень чистоты ферментных препаратов, получаемых осаждением органическими растворителями. Добавление в раствор ионов кальция приводит к созданию мостичных связей или комплексных соединений, что способствует образованию разветвленных агрегатов. [c.79]

Элюент (буферный раствор или раствор соды) заливают в сосуд и определенный объем его выливается на поверхность сорбата (сорбент с сорбированным ферментом). Затем включают на 10—20 мин мешалку вакуум-фильтра для элюции амилолитических ферментов, после чего элюат отфильтровывают в сборный сосуд для последующего осаждения органическими растворителями. [c.109]

Осаждение органическими растворителями вызывает частичную инактивацию ферментов, которая будет зависеть как от продолжительности контакта с органическим растворителем, так и от температуры. Повышение температуры вызовет увеличение кинетической энергии белковых молекул, способствующее лучшему контакту ионогенных групп с органическим растворителем, что может привести к изменению конформации активного центра, проявляющемуся в уменьшении ферментативной активности. Понижение температуры белкового раствора повлечет за собой уменьшение растворимости белков (ферментов). [c.131]

Выделять ферменты в чистом виде довольно трудно. Известно несколько методов выделения ферментов, основанных на экстрагировании их из микроорганизмов водой или глицерином, на извлечении путем изменения pH среды под влиянием растворов нейтральных солей (метод высаливания), на осаждении различными органическими растворителями (ацетон, спирт) и др. [c.520]

Выпускаемые в СССР ферментные препараты принято обозначать следующим образом первая буква П или Г указывает на способ культивирования продуцента — поверхностный или глубинный следующие за ней цифры показывают степень очистки фермента в процессе его получения — чем выше очистка, тем больше число наличие фермента в препарате обозначается буквой X . Например препарат марки ГЛОХ — обычно получают водной экстракцией из поверхностной культуры и последующим осаждением органическими растворителями. [c.107]

ОСАЖДЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ ОРГАНИЧЕСКИМИ РАСТВОРИТЕЛЯМИ [c.117]

Образующиеся в процессе фракционирования осадки в большинстве случаев отделяют от маточного раствора на рефрижераторной центрифуге. Значения g, указываемые в предлагаемых методиках выделения ферментов, можно, как правило, снижать, соответственно увеличивая время центрифугирования (при фракционировании органическими растворителями этого делать не следует). Всегда нужно стремиться получать осадки максимальной плотности это увеличивает эффективность фракционирования, если выделяемый фермент находится в осадке, и повышает его общий выход, если он находится в маточном растворе. Получение плотного осадка после осаждения фермента органическими растворителями позволяет быстро понизить их концентрацию последующим добавлением небольшого объема воды или буферного раствора. [c.197]

Из сборника вытяжка поступает в смеситель, где происходит взаимодействие спирта с белками вытяжки, приводящее к осаждению ферментов (и сопутствующих им высокомолекулярных соединений, не осажденных при повышении pH вытяжки). В смесителе спирт с вытяжкой тщательно перемешивается мешалкой в течение 10 мин. Из смесителя водно-спиртовая суспензия направляется в центрифугу для отделения осадка ферментного препарата. При этом необходимо следить, чтобы температура ферментного осадка в процессе сепарирования не поднималась сверх 20 °С. Это достигается установлением оптимального режима работы сепаратора и соответствующим охлаждением ферментного раствора и органического растворителя, применяемого для осаждения. [c.135]

Поверхностное культивирование обеспечивает наиболее близкие к физиологическим условия роста гриба. Однако рост гриба происходит обычно медленно из-за отсутствия эффективного массопереноса и стерических ограничений. Трудно наладить эффективный теплообмен, в особенности если используются толстые слои среды. Ферментный препарат малоактивен, поскольку содержит в основном мицелий и остатки среды, поэтому для его обогащения проводят экстракцию ферментов из поверхностной культуры водой с последующей сушкой или осаждением ферментов из экстракта органическими растворителями. Наконец, поверхностные культуры образуют, как правило, большое количество спор, обладающих аллергическим действием. [c.108]

В начале, по-видимому, всегда целесообразно отделить заметную часть балластных белков путем фракционной денатурации прогреванием или осаждением в слабокислой среде. Наоборот, кристаллизацию выгоднее проводить на заключительных этапах очистки. Основными операциями, выполняемыми на средних стадиях, являются фракционирование органическими растворителями, нейтральными солями, адсорбцией или хроматографическим разделением на колонках, в том числе с применением ионообменников. Очень важно, по возможности, чередовать этапы таким образом, чтобы избежать операции диализа. Так, высаливание, удобное в качестве первого этапа, требует диализа, но фракционирование спиртом позволяет его избежать. Простого прибора для быстрого диализа больших объемов жидкостей пока еще не существует можно полагать, что из всех способов очистки диализ — самый медленный и неудобный. Его легче проводить в заключительных стадиях, когда вещества уже мало и объемы невелики. Во время диализа возможны значительные потери активности фермента. С большими объемами жидкостей неудобно работать и в колонках последние лучше использовать [c.155]

Излагается теория осаждения ферментов органическими растворителями и электролитами. Кратко описываются основы перегонки спирта, применяемого для осаждения ферментов и регенерируемого в процессе производства ферментов. Даются теоретические основы упаривания растворов ферментов, сушки, а также стабилизации, стандартизации и хранения ферментных препаратов. [c.2]

В пятой главе излагается теория осаждения ферментов органическими растворителями и электролитами. Показано влияние химической природы органических растворителей и изложен механизм действия органических растворителей и электролитов на осаждение ферментов. Здесь же кратко описываются теоретические основы перегонки спирта, применяемого для осаждения ферментов и регенерируемого в процессе производства ферментов. [c.4]

Фракционирование проводилось осаждением ферментов органическими растворителями. Исследованиями показано, что при 53—56%-ной концентрации этилового спирта в растворе осаждается до 95% протеазы и только 7,5% амилазы. [c.61]

Влияние химической природы органических растворителей на осаждение ферментов [c.121]

Полнота осаждения ферментов органическими растворителями определялась содержанием амилазы (АС) как в осадке после центрифугирования, так и в надосадочной жидкости. Следует указать, что концентрация спирта в реакционной смеси до 80% не искажает результатов определения АС. Это позволило с достаточной точностью вести наблюдения за переходом ферментов в осадок по мере изменения концентрации органического растворителя. [c.121]

Следовательно, уменьшение притяжения активных групп фермента к молекулам воды обусловлено главным образом снижением диэлектрической постоянной среды. Отметим, что это положение справедливо лишь для водных растворов органических растворителей, не вызывающих инактивирования ферментов. Метиловый спирт, например, диэлектрическая постоянная которого равна 35,4, вызывает в водном растворе значительную инактивацию амилолитических ферментов, в связи с чем его не следует применять для осаждения амилолитических ферментов. [c.126]

Осаждение ферментов этиловым спиртом из концентрированных растворов (вытяжек) показало, что процесс осаждения из них протекает значительно хуже, чем из растворов средних и слабых концентраций, а расход органического растворителя (спирта) не соответствует повышению концентрации раствора. [c.127]

Добавление к водному экстракту, содержащему белки, таких растворителей, как этанол или ацетон, вызывает различные эффекты, которые вместе приводят к осаждению белка. Основной эффект заключается в снижении активности воды. По мере возрастания концентрации органических растворителей снижается способность воды к сольватации заряженных гидрофильных молекул фермента. Это можно объяснить снижением диэлектрической постоянной растворителя или же просто вытеснением большой массы воды и частичной иммобилизацией ее молекул вследствие гидратации молекул органического растворителя. Молекулы воды, расположенные упорядоченным образом вокруг гидрофобных участков на поверхности белка, могут быть замещены молекулами органического растворителя, что приводит к относительно более высокой растворимости этих участков. Некоторые сильно гидрофобные белки (обычно мембранные) могут растворяться в 100%-ном органическом растворителе. Однако суммарное действие органических растворителей ка цитоплазматические и другие водорастворимые белки состоит в снижении их растворимости до уровня, при котором начинаются агрегация и осаждение. [c.73]

При осаждении ферментов органическими растворителями природа растворителя изменяется, э связи с чем степень диссоциации кислых групп белковой молекулы уменьшается и, следовательно, рК их будет возрастать. Это может также привести к изменению третичной структуры белка, поскольку при увеличении значения рК изменяется положение ионогенных групп белковой молекулы. [c.131]

С целью уменьшения степени инактивации ферментов их осаждение следует проводить при охлаждении вытяжки и органического растворителя (спирта или ацетона) до О—2°С и при оптимальном значении pH. [c.131]

На растворимость ферментов оказывает большое влияние величина pH. В изоэлектрической точке белки обладают минимальной растворимостью. Вследствие этого осаждение ферментов органическими растворителями и электролитами следует проводить при значении pH, близком к изоэлектрическому состоянию, т. е. при котором общий заряд белка равен нулю. [c.136]

После вакуум-выпаривания и последующего вакуум-высушивания (или сублимации), а также после осаждения экстрактов органическими растворителями и высушивания осадка в вакууме получается растворимый порошок ферментов, который долгое время (более двух лет) сохраняет первоначальную активность. [c.160]

Для дробного осаждения можно применять и органические растворители (ацетон, метиловый спирт, этиловый спирт, диоксан), которые уменьшают количество гидратной воды, связанной с ферментом, и вызывают его осаждение. Поскольку ферменты в присутствии органических растворителей легко инактивируются, такое фракционирование проводят при низких температурах. [c.200]

Полученная бесклеточная культуральная жидкость перерабаты-. вается далее одним из подходящих способов. Например, в производстве ферментных препаратов — это чаще всего экстракция, осаждение из растворов органическим растворителем (спиртом и т. п.). или высаливание добавкой сульфата натрия и других солей с высокой растворимостью в воде. Последующая очистка ферментов может быть осуществлена повторными операциями осаждения или даже перекристаллизацией, хотя последняя в этих производствах применяется относительно редко. [c.26]

При очистке фермента оптимальным считают центрифугирование, при котором получают плотный осадок и прозрачную надосадочную жидкость для этого можно пойти на увеличение времени центрифугирования. Осадки, полученные высаливанием, изоэлектрическим осаждением, осаждением в органических растворителях и другими методами, описанными в гл. 3, обычно центрифугируют при 15 ООО в течение 110 мин или при 5000 г в течение 30 мин. Следует отметить, что при работе с малыми объемами центрифугирование при 5000 в течение 30 мин может дать удовлетворительные результаты, если расстояние от мениска до дна пробирки равно 5 см. При работе же с большими объемами, когда это расстояние может достигать 20 см, 30 мин иногда недостаточно. Выше указаны лишь приблизительные величины g, так как при данной скорости вращения д возрастает по мере оседания частиц. Однако, если говорить не о величине а о скорости вращения и, из уравнения (1.1) следует, что время осаждения зависит не от абсолютной длины пути осаждаемой частицы, а от логарифма соотношения Хь и Xt. Эта величина лишь незначительно варьирует в разных центрифугах. Поэтому центрифугирование при 5000 об/мин в течение 30 мин дает сходные результаты во всех центрифугах. [c.16]

Вместо растворения твердой соли в образце в него можно добавлять нужное количество насыщенного раствора так же, как это делается при добавлении органических растворителей (разд. 3.4). Такой прием особенно полезен, если фермент полностью осаждается при 50%-ном насыщении, так как при этом объем возрастает только в два раза. При работе в больших масштабах добавление сульфата аммония в виде раствора неприемлемо, но для выделения белков в малых количествах это вполне подходящий метод. При более высоком проценте насыщения объем раствора увеличивается еще больше, а происходящее при этом разбавление белка в свою очередь требует еще более высокой степени насыщения, чтобы осаждение было столь же эффективным. Поэтому данный метод не рекомендуется использовать при степени насыщения выше 50%. [c.71]

Некоторые органические растворители проявляют более сильное денатурирующее действие, чем другие. Давно установлено, что спирты с длинной цепью обладают более высокой денатурирующей способностью по сравнению с короткоцепочечными спиртами. Примеры этого приведены в разд. 3.5. Хотя этанол и используется в стандартных методах фракционирования белков плазмы [30], необходимо отметить, что эти белки (лишь немногие из них относятся к ферментам) составляют группу, характеризующуюся необычной стабильностью и переносящую условия, в которых денатурируют более чувствительные белки. Ацетон обладает менее денатурирующим действием, чем этанол, отчасти потому, что при низкой температуре требуются несколько более низкие его концентрации, чтобы получить такое же осаждение, как и при использовании этанола. Он также более летуч, что позволяет легко удалять его из растворенного осадка при пониженном давлении. [c.76]

В промьшшенности для вьщеления ферментов применяют методы, основанные на изменении растворимости фермента в системе. Наиболее широко используется метод высаливания нейтральными солями либо осаждение органическими растворителями, чаще всего пepвичньпvlи спиртами. Недостатки перечисленных методов — загрязнение сточных вод солями, пожароопасность производства - стимулируют разработку более эффективных и менее опасных способов выделения ферментов. Одним из таких путей представляется использование флокулянтов. [c.130]

В процессе выделения ферментов, других белков и нуклеиновых кислот биополимеры нередко получают в виде сильно разбавленных растворов, которые для дальнейшей работы необходимо концентрировать. Среди известных методов концентрирования биополимеров — высаливанием, осаждением органическим растворителями, испарением в мешочках для диализа, диализом против гипертонических растворов полимеров и др. — одним из наиболее удобных является метод ультрафильтрации. Этот метод 110з.воля т проводить концентрирование при очень мягких условиях низкой температуре, широких значениях pH, любой ионной силе раствора. Существенно, что концентрирование биополимеров происходит без концентрирования растворителя. Таким образом, денатурирующие воздействия самой процедуры сведены к минимуму. [c.231]

При осаждении ферментов из культуральной жидкости с помощью сернокислого аммония (65 % насыщения) образуется осй ок, имеющий массу 297 мг и активность 1,2 ед При осаждении органическими растворителями масса осадков колеблется от 56 мг для изопропилового спирта до 49 мг для ацетона, но белка больше содержится в осадках, полученных при осаждении ацетоном и изопропиловьая спиртом. [c.70]

Депротеинизация достигается также добавлением сульфата аммония и некоторых органических растворителей [23]. Основная опасность здесь заключается в возможности адсорбции или окклюзии следовых компонентов осадком. Эффективность операции нужно конфолировать в отношении биоматериала и определяемых веществ. Обычно влияние окклюзии сводят к минимуму не добавлением осаждающих агентов к пробе, а наоборот [24]. В последнее время для осаждения белков все чаще применяют ацетонитрил, особенно удобный в тех случаях, когда раствор далее анализируют методом ВЭЖХ Для предотвращения разложения белков следует избегать нафевания, либо использовать мягкие условия их разрушения с помощью ферментов [25]. С этой целью используют трипсин, папаини другие протеиназы. Ткани печени гидролизуют алкалазой, а [c.204]

Для фракционной очистки с применением органических растворителей используют спирты (этанол, метанол, изопропанол, ацетон,реже—диоксан, диэтилкарбинол, ароматические и гетероциклические амины. Для уменьшения денатурирующего воздействия осаждение ведут при пониженных температурах [4, 6, 49]. При фракционировании ферментов под действием солей часто используют сульфат аммония, реже применяют сульфаты и ацетатьт натрия и магния. В отличие от органических растворителей, которые сравнительно легко удаляются цен-Т15ифугированием, солевые осадители из полу генного препарата можно удалить диализом, занимающим продолжительное время. [c.169]

Если целевой продукт представляет собой растворимый Метаболит или он синтезируется внутри клетки и не секретируется вовне, то прибегают к другим методам выделения экстр)акцни, сорбции, осаждению, хроматографии, выделению с помощью мембран. Экстракцию проводят органическими растворителями из клеток (твердая фаза), например, антибиотика гризеофульвина ацетоном, или бензилпенициллина при pH 2,0—3,0 — бутил-ацетатом из культуральной жидкости после отделения клеток продуцента (система "жидкость-жидкость"), или, наконец, экстракция ферментов (в частности, пуллуланазы) в двуфазных водных системах, например, глюкана-декстрана и несовместимого с ним поли-этиленгликоля (ПЭГ-6000). [c.388]

Присутствие органических растворителей является помехой при определении активности почти всех ферментов. Поэтому при осаждении фермента растворителем (спиртом, ацетоном, диоксаном и т. п.) активность следует контролировать только после отделения осажденного белка, его растворения и удаления остатков спирта, ацетона и т. п. По сравнению с фракционированием в растворах солей обработка органическими, легко летучими веществами, имеет то преимущество, что получение готового препарата и его высушивание может быть вьшолнено сразу, без предварительного диализа растворов, а следовательно, без разбавления и частичной (дополнительной) инактивации, которые часто сопутствуют диализу. [c.146]

Принцип получения микрокапсул с белковым содержимым достаточно прост. Создается микроэмульсия водного раствора вещества в органическом растворителе. Полимерный материал растворен во внещней фазе, к которой добавляют вещества, способствующие его осаждению на капле эмульсии. Растворы могут содержать также мономеры, полимеризующиеся на границе раздела фаз. Используются и другие способы, которые специально подбираются в зависимости от содержимого микрокапсулы. Кинетика действия фермента в микрокапсулированном состоянии [c.128]

Соли кальция способствуют уменьшению количества органического растворителя, расходуемого для осаждения ферментного комплекса, и улучшению качества ферментных осадков (препарата амилазы из гриба Asp. oryzae) вследствие образования агрегатов белковых молекул. Оптимальная концентрация органического растворителя, вызывающая осаждение различных ферментов, зависит от размеров молекул и их конформации. [c.143]

При очистке веществ белково-пептидной природы (в частности, ферментов), которые растворимы лишь в воде и водных растворах, нередко используют приемы, основанные на уменьшении их растворимости при прибавлении к водным растворам солей или смешивающихся с водой органических растворителей. Увеличивая концентрацию соли (например, сернокислого аммония или поваренной соли) в воде, можно осадить те или иные из растворенных веществ. Таким путем удается значительно очистить ферменты от сопровождающих веществ, так как нередко изучаемое вещество осаждается при другой концентрации соли, чем примеси (дробное осаждение). Повторяя такой процесс с небольшими модификациями (осаждение при разных значениях pH и при различной концентрации солей), обычно удается получить концентраты фермента (или другого биорегулятора) высокой степени очистки, но содержащие значительные примеси солей. Последние удаляют посредством диализа (при котором низкомолекулярные вещества проходят через полупроницаемую пленку, например из целлофана, и удаляются, а высокомолекулярные остаются) или путем гельхроматографии (в последнее время), что значите, ьно быстрее. [c.21]

Группоспецифические мукополисахариды крови человека обычно получают экстракцией 90- или 95%-ным фенолом лиофнлизованных биологических жидкостей, таких, как слюна, желудочный сок, жидкость кисты яичника, меконий, а также тканей, обработанных протеолитиче-скими ферментами. Большинство активных веществ нерастворимо в этом растворителе. Если же они оказываются растворимыми, как, например, вещества, выделенные из тканей, обработанных пепсином при pH 1—2, то их легко можно осадить прибавлением небольших количеств спирта. Мукополисахариды, полученные этим путем, в основном свободны от песпецифических белков и жиров, содержащихся в нативных выделениях и экстрактах тканей, и представляют собой материал, который после дальнейшей очистки фракционным осаждением из водных растворов подходящим органическим растворителем наиболее часто употребляется для химических и серологических исследований (см. Кабат [1] и Морган [2]). [c.336]

Допустим, что перед исследователем стоит задача определить природу дефекта у мутантной мыщи, синтезирующей аномально низкое количество альбумина (белка, который в норме секретируется в кровь клетками печени в значительных количествах). Для этого прежде всего необходимо взять образцы ткани печени у дефектных и нормальных мыщей (последние служат в качестве контролей) и обработать клетки сильным детергентом для инактивации клеточных нуклеаз, которые в противном случае могут разрушить нуклеиновые кислоты. Затем отделяют РНК и ДНК от всех других компонентов клетки присутствующие белки при этом полностью денатурируются, их удаляют последовательной экстракпией фенолом - мощным органическим растворителем. Нуклеиновые кислоты остаются в водной фазе. Чтобы их отделить от низкомолекулярных клеточных соединений, проводят осаждение спиртом. После этого ДНК отделяют от РНК, пользуясь их различной растворимостью в спиртах и обрабатывают высокоспецифическими ферментами (соответственно РНКазой или ДНКазой), чтобы освободиться от нежелательных примесей нуклеиновых кислот. [c.239]

Приготовление экстрактов из дрожжей связано с несколькими проблемами. Главная из них состоит в том, что клеточные стенки у грибов очень толстые и их трудно разрушить. Поэтому для получения экстракта требуются более эффективные методы. Если экстракт нужно получить быстро, единственный надежный способ — это применение вибрационной шаровой мельницы или гомогенизатора Мэитона — Гаулина. При использовании этих методов образуется большое количество частиц низкой плотности, которые не полностью удаляются центрифугированием. Мутность может снизить эффективность осаждения белка сульфатом аммония. Однако ее можно устранить путем агрегации частиц в органическом растворителе (ацетон, 20— 25% по объему при 0°С). В прозрачном растворе остается большинство ферментов, которые осаждаются при повышении концентрации ацетона (разд. 3.4). Прозрачные экстракты получают также, используя автолиз толуолом, но в этих условиях может происходить протеолитическое расщепление белков. [c.51]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология