Промоторы гибридные

Руководитель предоставила вам две плазмиды (схематически изображенные на рис. 8-5). Каждая из них содержит гибридный ген, находящийся под контролем регулируемого промотора. Гибридный ген образовался в результате слияния гена, продукт [c.105]

Транскрипционные конструкции могут создаваться двумя путями во-первых, это установка промотора рядом с УСР, который узнается полимеразой Е. соИ, во-вторых, это формирование гибридного УСР, состоящего из прокариотической последователь- [c.150]

Литическая комплементация гораздо проще. Клетки His заражают пулом гибридных фагов и высевают на минимальные чашки без гистидина. Тот фаг, который комплементирует клетки His , должен бы образовывать бляшки. Однако все клетки заражены и потому не могут расти и образовывать газон. В результате если проводить высев обычным образом, то должны бы образоваться бляшки (прозрачные пятна) на прозрачной чашке. Поэтому важно, чтобы на такие чашки высевалось очень много клеток — столько, чтобы чашка слегка замутилась. Тогда можно будет ясно разглядеть прозрачные бляшки. Так как во время литического цикла происходит активная транскрипция генома фага X, то желательно, чтобы клонированная последовательность, попавшая в центральную область генома фага, транскрибировалась и с какого-нибудь фагового промотора. В этом случае встроенные гены могут экспрессироваться во время литического цикла инфекции, даже если при них нет собственного промотора. Поэтому фаг, выявленный на основании результатов комплементации при литической инфекции, может быть и неспособным комплементировать в двойном лизогене. Поскольку бля- [c.43]

Селекционер, занимающийся выведением новых сортов растений или пород животных, может с помощью подбора родительских форм получить гибридное потомство, у которого активность отдельных генов выше или ниже по сравнению с обычным уровнем, характерным для какого-либо растения или животного. Это могут быть сорта картофеля с повышенным содержанием крахмала или сорта рапса, не содержащие в масле токсичные вещества типа эруковой кислоты. Но селекционер не может заставить листья того же рапса образовывать масло, которое обычно синтезируется в семенах, хотя в хромосомах клеток листа содержится вся нужная для этого информация. Конечно, можно попытаться обмануть растение, заставив его листья образовывать масло. Для этого необходимо у гена, кодирующего образование масло, поменять промотор, поставив его под промотор того гена, который функционирует в листьях. Однако здесь кончается традиционная селекция и начинается генетическая инженерия. [c.20]

В лаборатории Б, Ройзмана в 1983 г. в составе бактериальной плазмиды состыковали промотор гена а4 HSV-1 и кодирующую последовательность хромосомного гена овальбумина курицы. Экспрессия гибридного гена была подвержена ташй же регуляции, как и экспрессия вирусного гена 4. На следующем этапе (1984 г.) в той же лаборатории в ген тимидинкиназы вируса простого герпеса рекомбинационно встроили ген-эквивалент поверхностного антигена S вируса гепатита В, объединенный с промотором либо гена а4, либо гена tk HSV-1. Отобранные по фенотипу TK гибридные варианты HSV-1 направляли эффективный синтез HBsAg, который секретировался из клеток и формировал специфичные частицы диаметром около 22 нм. Причем в зависимости от использованного промотора гибридный ген S экспрессировался или как ранний ген, или как ген -типа. [c.386]

Были рассмотрены три группы эукариотических генов, транс-[ крипция которых осуществляется разными РНК-полимеразами при участии белковых факторов, взаимодействующих с характерными для каждой группы регуляторными элементами. Однако кроме них существуют еще гибридные системы транскрипции, в которых, по-видимому, одновременно могут использоваться способы регуляции, представленные в каяадом из рассмотренных типов транскрипции. Так, РНК-полимераза П1 транскрибирует гены алых ядерных РНК (см. гл. Vni) типа U6, а также гены 7SK РНК неизвестной функции, хотя те и другие не содержат внутренних промоторов и, напротив, на 5 -конце несут ряд элементов, характерных для систем транскрипции с помощью РНК-полимеразы П. [c.212]

Метод трансфекции успешно применяется для введения генов в геном животных (рис. 38.14). Плазмиды, несущие интересующий исследователей ген, вводятся в зародышевый пузырек (ядро) ооцита мыши или в пронуклеус оплодотворенного яйца. Затем это яйцо имплантируется самке. Таким образом, были введены гены глобина и гибридные гены, содержащие промотор для металлотионеина, который сцеплен с кодирующей последовательностью тимидинкиназы. Промотор МТ ведет происхождение от природного гена мыши его присутствие можно определить по способности отвечать на обычную индукцию тяжелыми металлами или глюкокор-тикоидами (ответ определяют по активности тимидинкиназы). [c.501]

Биологическая роль Л-формы является предметом дискуссий. Известно, например, что двуспиральные участки и РНК находятся в Л-конформации. Это происходит потому, что 2-ОН-группа рибозы в РНК, в отличие от пентозы ДНК, не может вписаться в тесное пространство сахарно-фосфатного остова S-формы. В образовательной Л-форме РНК этот гидроксил направлен наружу и не испытывает никаких стерических ограничений. В процессах транскрипции должен образовываться гибрид РНК-ДНК. Очевидно, для образования такого гибридно рибозо-дезоксирибозного РНК-ДНК дуплекса предпочтительно наличие Л-формы ДНК. Промоторы, или места связывания РНК-полимеров с ДНК в процессе транскрипции, занимают малую долю природной ДНК, находяш ейся в S-форме. Оказалось, что РНК-полимеразы могут, взаимодействуя с ДНК, переводить ее наибольшую часть в Л-конформацию (Иванов В. А., 1972 Жакобо - Молина, 1993). [c.224]

Возможность экспрессии клонированных эукариотических генов в клетках Е. соИ способствовала углубленному изучению множества белков, представляющих интерес для фундаментальных научных исследований и медицины. В тех случаях, когда нативный негибридный белок экспрессируется недостаточно эффективно, часто экспрессия белков или их фрагментов в виде гибридов с полипептидами Е.соИ, такими, как -галактозидаза, оказывалась более успешной. К тому же гибридные белки можно легко очищать с помощью хроматографических методов, разработанных для -галактозидазы. Эукариотические белки, экспрессируемые в составе гибридных продуктов, были с успехом использованы при изучении иммунологически важных участков поверхностных антигенов [1], функций рекомбинантных полипептидов [2], при получении иммунологических зондов, необходимых для исследования ранее не изученных антигенов [3—6], для экспрессии вариантных форм белковых субъединиц и для выделения и исследования клонов ДНК из экспрессирующихся библиотек генов [8—10]. Технология работы с экспрессирующими векторами достигла столь высокого уровня развития, что стало возможным осуществлять в клетках Е. соН достаточно эффективную экспрессию практически любой кодирующей последовательности с образованием гибридного продукта, который можно выделить с помощью разнообразных биохимических методов и использовать его либо в различных функциональных исследованиях либо в качестве иммуногена. Синтез чужеродного полипептида в виде гибридного белка с -галактозидазой, по всей вероятности, значительно увеличивает стабильность этого полипептида в клетках Е. соИ. По-видимому, стабильность белка, а не сила промотора — наиболее важный фактор для успешной экспрессии рекомбинантных белков в бактериях. [c.138]

В генной инженерии часто используют сильные промоторы Е. соИ [лактозного оперона — la UV5, триптофанового — trp, гибридный промотор ta (trp —la )], промоторы фага Я —Pr и Pl, некоторые сильные промоторы фагов Т5, Т7, фХ174 и т.д. [c.156]

E. Remaut et al., 1983). Авторы использовали фрагмент ДНК, кодирующий зрелый интерферон , соединенный с гибридной экспрессирующей областью, содержащей левый промотор фага X, —Pl и участок связывания рибосом гена репликазы фага MS2. Объединенная конструкция была встроена в плазмиду olEl-типа, и последняя введена путем трансформации в штаммы Е. соИ, несущие в геноме дефектный профаг с ts-репрессором X. Таким образом получена регулируемая система. При 28°С, когда репрессор функционирует, синтез интерферона не происходит, культура накапливает биомассу. Через 3 ч после индукции при 42°С количество -интерферона составляет 2% от суммарного белка (около 10 молекул на клетку). Принцип применения регулируемых промоторов может оказаться очень полезным во многих других случаях. [c.196]

В оплодотворенные яйца животных вводили ДНК методом миКроинъекции и имплантировали эти яйца в половые пути псевдобеременных самок (Gordon et al., 1980). С помощью такого внедрения чужеродного гибридного гена в зачатковые клетки были получены гигантские мыши. Промотор гена ме-таллотионеин-1 мыши был слит со структурным геном гормона роста крысы и введен методом микроинъекции в мышиные яйца. Рост мышей резко усиливался. Чужеродная ДНК включалась в хромосомы мыши и передавалась через клетки зародышевой линии (Palmiter et al., 1982). [c.304]

Система Y2H включает в себя два гибридных белка приманку (bait) - X-AD и хищника (ргеу) - Y-DBD, каждый из них, в свою очередь, построен из двух половин белков X или Y, взаимодействие между которыми исследуется, а также одного из двух доменов активатора транскрипции DBD или AD (рис. 49, а). Кроме того, интегральной частью системы Y2H является ген-репор-тер, находящийся под контролем промотора, активируемого фактором транскрипции с доменами AD и DBD. Если белки X и Y взаимодействуют между собой, то их димеризация будет сопровождаться сближением ассоциированных с ними доменов, что приведет к образованию гетеродимера с активностью исходного фактора транскрипции и активацией гена-репортера, экспрессию которого легко обнаружить фенотипически, например, по ферментативной активности кодируемого этим геном белка. Плаз-миду- приманку и плазмиду- хищника вводят в гаплоидные клетки дрожжей, относящиеся к разным типам спаривания, а и а, скрещивание между которыми приводит к образованию диплоидных штаммов, содержащих обе плазмиды. [c.356]

Проблема ложноположительных и ложноотрицательных результатов при использовании системы Y2H. Ложноположительные результаты, в которых желаемое выступает под видом действительного, являются неизменными спутниками любой научно-исследовательской работы, в том числе, и систем отбора белков in vivo. По механизму возникновения ложноположительные результаты можно разделить на две категории технические и биологические [132]. К первой группе относятся артефакты, не связанные со взаимодействием двух гибридных белков как таковым. В этом случае экспрессия некоторых гибридных белков сопровождается необъяснимой индукцией гена-репортера. Такие технические проблемы можно минимизировать, используя, например, несколько респонсивных промоторов для гена-репортера [133]. Ложноположительные результаты биологической природы являются следствием взаимодействия между исследуемыми белками, которого не происходит в клетке. Доля таких взаимо- [c.363]

Тригибридная дрожжевая система (Y3H) является дальнейшим развитием системы Y2H [118,142]. Этот вариант чаще всего используется с целью исследования РНК-белковых взаимодействий. Для активации (или в другой модификации ингибирования) транскрипции гена-репортера в ней задействованы три гибридных макромолекулы два гибридных белка, один из которых содержит DBD-домен, соединенный с универсальным РНК-связы-вающим доменом (в данном примере с белком оболочки фага MS2), и AD-домен, объединенный с белком Y, взаимодействие которого с конкретной последовательностью РНК анализируется (рис. 49, в). Третьим компонентом является гибридная РНК, содержащая универсальную якорную последовательность, взаимодействующую с белком MS2, и последовательность X, способность которой взаимодействовать с белком Y исследуется. В том случае, когда имеет место РНК-белковое взаимодействие, формируется тройной комплекс, активирующий промотор гена-ре-портера. В другом варианте система Y3H может быть использована для изучения взаимодействий белков-рецепторов с низкомолекулярными лигандами, получившими название химических индукторов димеризации ( hemi al indu ers of dimerization - ID) (рис. 49, г). В этом случае в качестве третьего компонента системы используют двойной лиганд L1-L2, у которого часть L1 взаимодействует с белком X, а взаимодействие L2 с белком Y исследуется. (Возможен и обратный вариант, когда изучается взаимодействие L1 с белком X.) При наличии взаимодействия происходит активация (или в других конструкциях подавление) активности гена-репортера. [c.368]

С помощью аналогичного подхода можно изменять специфичность и самих факторов транскрипции, что удалось продемонстрировать с помощью гибридных а-субъединиц РНК-полимеразы Е. соИ. В этих опытах объединяли N-концевую часть основной а о-субъединицы с С-концевой последовательностью а32-субъединицы, которая обеспечивает распознавание РНК-поли-меразой Е. соИ промоторов генов теплового шока. Полученный гибридный белок после объединения с минимальным ферментом РНК-полимеразы, не содержащим а-субъединицу, придавал ему способность инициировать транскрипцию на гибридных промоторах, составленных из консенсусных (-35)-последовательности а32-зависимых промоторов и (-Ю)-последовательности промоторов а о [181]. Путем замены в молекуле РНК-полимеразы Е. соН а-субъединицы дикого типа на гибридную а-субъединицу, которая содержала С-концевой домен а-субъединицы В. subtilis получали фермент, регулируемый активатором транскрипции этой бактерии [182]. [c.380]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология