Минимальный фермент

Рис. 10.2. Цикл сигма-фактора и минимального фермента при транскрипции.

Для терминации транскрипции на ДНК имеются особые сигналы — терминаторные последовательности. В этом случае терминация осуществляется минимальным ферментом, но иногда необходим дополнительный белковый фактор, названный ро (р). Таким образом, общая схема транскрипции выглядит так, как изображено на рисунке 235. [c.413]

Минимальный фермент сам по себе имеет сродство к ДНК в основе этого сродства лежит электростатическое взаимодействие между положительно заряженным белком и отрицательно заряженной нуклеиновой кислотой. Возможно, что способность к связыванию любой ДНК независимо от ее нуклеотидной последовательности-характерная особенность всех белков, имеющих специфические участки узнавания на ДНК (гл. 14). Случайная последовательность ДНК, которая связывается РНК-полимеразой, называется слабым участком связывания, а комплекс ДНК фермент закрытым, поскольку ДНК в этом комплексе находится в двухцепочечной форме. Константа связывания при формировании закрытого комплекса в участке слабого связывания составляет 2-10 М а полупериод диссоциации комплекса на фермент и ДНК-около 60 мин. [c.133]

Как показано на рис. 10.1, распознавание промоторов голоферментом существенным образом отличается от реакции минимального фермента со слабыми участками связывания. Взаимодействие голофермента с промотором начинается с формирования аналогичного закрытого (бинарного) комплекса. Но затем он переходит в открытый комплекс. При этом происходит плавление небольшого участка ДНК в пределах той последовательности, которая связана с ферментом. Обычно фермент экранирует примерно 60 нуклеотидных пар молекулы ДНК, внутри которых 12-17 пар нуклеотидов (согласно разным определениям, см. далее) находятся в неспаренном состоянии и образуют участок с одноцепочечной структурой. В результате ряда последовательных событий, приводящих к формированию открытого комплекса, происходит прочное связывание. [c.134]

Особенности этих типов связывания указывают на то, что РНК-полимераза может находить промоторы методом проб и ошибок, как это показано на рис. 10.2. Любой не работающий в данный момент в клетке минимальный фермент скорее всего существует в форме закрытых слабых комплексов, поскольку образование таких комплексов происходит быстро, а распад-медленно. (К сожалению, точно не известно, какая часть молекул свободных РНК-полимераз клетки существует в форме минимального фермента и какая представлена голоферментом.) Голо( рмент очень быстро ассоциирует со слабыми участками связывания и также быстро отделяется от них. Таким образом, продвигаясь вдоль молекулы ДНК, голофермент образует и разрушает ряд закрытых комплексов до тех пор, пока в процессе поиска (случайно) не натолкнется на промотор. Тогда в результате узнавания специфической последовательности он может прочно связаться с ДНК в нужном участке и образовать открытый комплекс. [c.134]

Освобождение минимального фермента происходит при терминации, после чего он либо связывается со свободными участками ДНК, либо с сигма-фактором, образуя голофермент, который стабильно взаимодействует только с промоторами. Сигма-фактор отделяется сразу же, как только образуется тройной комплекс. [c.134]

Сигма-фактор нужен только для инициации. Он сразу же освобождается из комплекса с минимальным ферментом, как только начинается синтез РНК. [c.135]

После того как сформируется открытый (бинарный) комплекс, следующим шагом является включение двух первых нуклеотидов и образование фосфодиэфирной связи между ними. Это приводит к образованию тройного комплекса между минимальным ферментом ДНК и синтезирующейся РНК (рис. 10.1). Данная реакция протекает настолько быстро, что период полужизни бинарного комплекса в участке прочного связывания составляет всего лишь 0,2 с. Инициация заканчивается формированием тройного комплекса, и сигма-фактор уже не является его составной частью. [c.135]

Прямая взаимосвязь между освобождением сигма-фактора и синтезом фосфодиэфирной связи неизвестна. Возможно, сигма-фактор непосредственно замещается динуклеотидом образующейся РНК возможно также, что его удаление из комплекса может быть индуцировано изменением свойств минимального фермента, происшедшим под воздействием синтезирующейся РНК. В любом случае, начиная с момента образования первой фосфодиэфирной связи, транскрипция осуществляется тройным комплексом, содержащим минимальный фермент. [c.135]

Минимальный фермент в составе тройного комплекса очень прочно связан с ДНК. Он как бы заперт в нем до тех пор, пока не закончится элонгация. Когда же транскрипция завершается, минимальный фермент отделяется [c.135]

Наличие цикличности во временном объединении сигма-фактора с минимальным ферментом решает дилемму, стоящую перед РНК-полимеразой привести в соответствие взаимодействие фермента с матрицей при инициации и элонгации. Это в самом деле дилемма, поскольку для инициации требуется прочное взаимодействие только с определенными последовательностями (промоторами), тогда как при элонгации необходимо прочное связывание со всеми последовательностями, вдоль которых происходит движение фермента. Минимальному ферменту присуще высокое сродство к ДНК, которое увеличивается в присутствии новосинтезированной РНК. Однако его сродство к слабым участкам связывания слишком велико, чтобы позволить ферменту эффективно находить промоторы. При этом поиск участков прочного связывания методом проб и ошибок путем ассоциации и диссоциации может длиться много часов. Сигма-фактор значительно ускоряет этот процесс, уменьшая стабильность слабых комплексов. В то же время, стабилизируя ассоциацию в участках прочного связывания, сигма-фактор необратимо сдвигает реакцию в сторону образования открытых комплексов. Но затем действия голофермента парализуются его же собственным специфическим сродством к промоторам. Поэтому, освобождаясь от сигма-фактора, фермент снова способен связываться с любой последовательностью ДНК, что позволяет ему продолжать транскрипцию. [c.135]

Минимальный фермент синтезирует РНК [c.135]

Существуют ли терминаторы полностью независимые от фактора р Некоторые терминаторы in vitro при встрече с минимальным ферментом, по видимому, способны в одиночку осуществлять весь комплекс термина-ционных реакций. Это так называемые р-независимые терминаторы. Однако мы должны с осторожностью трактовать эти данные, так как возможно, что в действительности в бактериальной клетке фактор р также необходим для узнавания таких сигналов терминации. In vitro в отсутствие фактора р эти терминаторы проявляют свое действие только тогда, когда транскрипция происходит в условиях относительно высокой ионной силы. При этом, возможно, истинная (при низкой ионной силе) зависимость от фактора р не тестируется. [c.163]

Минимальный фермент должен удерживать две реагирующие группы в таком положении, которое благоприятно для образования фосфодиэфирной связи. Как только ковалентная связь возникла, фермент продвигается далее по матрице на один нуклеотид, с тем чтобы повторить реакцию. Скорость реакции при 37°С высокая - около 40 присоединенных нуклеотидов в 1 с (гл. 9). Как показано на рис. 10.3, последний нуклеотид растущей цепи определяет участок связывания затравки. Область, занимаемая присоединяемым нуклеозидтрифосфатом, образует участок элонгации. [c.136]

Для функционирования РНК-полимеразы важное значение имеют двухвалентные катионы. Рибонуклеотиды поступают в участок элонгации нуклеотидов в форме хе-латных соединений -NTP. Минимальный фермент [c.136]

Функции субъединиц минимального фермента [c.137]

Мы располагаем весьма ограниченными данными о пространственной организации минимального фермента, и самое большее, что мы можем сделать,-это построить схематическую диаграмму участков, определяющих различные ферментативные функции (как это показано на рис. 10.3). Ни один из этих участков пока еще не локализован ни на одной из полипептидных субъединиц. Однако некоторая общая информация о роли отдельных субъединиц уже имеется. [c.137]

Ни одну из субъединиц нельзя считать участком связывания для а. Все они, по-видимому, прямо или косвенно участвуют в превращении минимального фермента в голофермент. [c.137]

РНК-полимеразы фагов, возможно, являются минимальными ферментами [c.137]

Сразу же, как только стало ясно, что функции РНК-полимеразы подразделяются между минимальным ферментом, ответственным за элонгацию синтезирующейся РНК, и сигма-фактором (а-фактором), участвующим в выборе промотора, возник вопрос о возможности существования нескольких типов сигма-факторов, специфичных для разных классов промоторов. Как правило, такой механизм сам по себе, по-видимому, не используется для контроля транскрипции у бактерий. Но при определенных обстоятельствах в жизненном цикле бактериальной клетки происходят коренные изменения. При этом наблюдается выключение транскрипции ранее экспрессируемых генов и включение новых транскрипционных единиц. В этих случаях, возможно, происходит введение долговременных изменений непосредственно в РНК-полимеразу. [c.157]

Комплекс, состоящий из а и минимального фермента,транскрибирует ранние гены, участвующие в спорообразовании [c.158]

Последовательная замена сигма-фактора имеет двоякое значение. При каждой замене этой субъединицы РНК-полимераза становится способной узнавать новый класс генов и фермент уже не транскрибирует предшествующие гены. Таким образом, эти переключения приводят к системным изменениям в активности РНК-поли-меразы. Вероятно, весь или фактически весь минимальный фермент клетки связывается с той сигма-субъединицей, которая должна функционировать в данный момент, причем это взаимодействие необратимо. [c.159]

Для характеристики фермента представляет интерес тот факт, что субъединицы различного размера могут выполнять одну и ту же функцию. Они придают способность минимальному ферменту распознавать определенную группу промоторов. Совокупность данных о процессах, протекающих при спорообразовании и фаговой инфекции, открыла нам существование (по крайней мере) пяти различных сигма-факторов, с которыми может взаимодействовать минимальный фермент. Это [c.159]

Комплекс, состоящий из ЧР и минимального фермента, транскрибирует только средние фаговые гены [c.160]

Средние гены 33 и 34 кодируют белки, заменяющие и образующие комплекс с минимальным ферментом [c.160]

В связи с вопросом о специфичности узнавания промотора следует вспомнить, что уже довольно давно известно об изменениях в транскрипционной специфичности при инфицировании Е. соИ фагом Т4. Это обусловлено изменениями, происходящими как в сигма-факторе, так и в субъединицах минимального фермента. Их влияние трудно разделить, но, вероятно, оба компонента воз- [c.160]

Описывая события, происходящие при терминации, этот процесс необходимо рассматривать не просто как способ, обусловливающий образование З -конца молекулы РНК, а как удобный механизм, контролирующий генную экспрессию. Таким образом, и прикрепление РНК-полимеразы к ДНК (инициация), и отделение фермента от матрицы специфически контролируются. Обнаруживаются интересные аналогии между системами, участвующими в инициации и терминации. В обоих случаях должен обязательно происходить разрыв водородных связей (первоначальное плавление ДНК при инициации и диссоциация гибрида РНК—ДНК при терминации), и в обоих случаях требуются дополнительные белковые факторы, взаимодействующие с минимальным ферментом. Не исключено, что эти процессы осуществляются двумя различными формами ферментов. [c.162]

Достигнув палиндрома, минимальный фермент приостанавливается [c.164]

Голофермент (азрр а) можно разделить биохимическими методами на два компонента минимальный фермент ( зРр ) и сигма-фактор (а-полипептид). В названии компонентов отражен тот факт, что только голофермент может инициировать транскрипцию, а далее сигма-фак-тор освобождается из комплекса и собственно элонгация осуществляется минимальным ферментом. Таким образом, минимальный фермент способен синтезировать фосфодиэфирные связи на ДНК-матрице, но он не может инициировать транскрипцию в нужном участке. [c.133]

Каким образом сигма-фактор влияет на способность минимального фермента ассоциировать с ДНК Проведенные ранее эксперименты указывали на то, что сигма-субъединица непосредственно не связывается с дуплексом ДНК. Однако возможно, что она способна взаимодействовать с ДНК, находящейся в суперспирализованном состоянии, хотя мы не имеем данных о том, может ли она сама узнавать специфические нуклеотидные последовательности. В то же время известно, что когда голофермент образует прочно связанный комплекс с промотором, сигма-фактор контактирует с ДНК в области начального плавления, в точке, расположенной непосредственно перед стартовой точкой транскрипции. Добавление сигма-фактора может изменить конформацию минимального фермента таким образом, что он менее эффективно распознает слабый участок связывания и уже в форме голофермента может специфически контактировать с участками прочного связывания. [c.135]

РНК транскрибируется только с одной цепи ДНК-ма-трицы. Для осуществления этого процесса цепи ДНК должны быть локально расплетены в данном участке. Минимальный фермент начинает транскрипцию на расплетенных цепях ДНК открытого промоторного комплекса. По мере передвижения фермента вдоль матрицы и роста цепи РНК область локального расплетения цепей движется вместе с ним. [c.135]

Выделенная в чистом виде а-субъединица существует в форме димера, способного связываться с -субъедини-цей затем комплекс aj присоединяет , образуя минимальный фермент. При инфицировании Е. соН фагом Т4 а-субъединица модифицируется в результате ADP-рибо-зилирования аргинина. Это сопровождается уменьшением сродства к обычным промоторам, распознаваемым голоферментом. Следовательно, вполне возможно, что а-субъединица играет какую-то роль в распознавании промотора. [c.137]

Фермент, обнаруживаемый у В. subtilis и участвующий в обычном вегетативном развитии, имеет такую же субъединичную структуру, как и фермент Е. o/i,-a2 r. Сигма-фактор в случае РНК-полимеразы В. subtilis имеет мол. массу 55000 дальтон (ст ) и вьшолняет те же функции, что и а-фактор из Е. соИ. В спорулирующих клетках можно обнаружить по крайней мере еще две формы РНК-полимеразы. Они содержат такой же минимальный фермент, как и РНК-полимераза вегетативных клеток, но [c.157]

Форма РНК-полимеразы, способная инициировать споруляцию, была обнаружена благодаря использованию гена, который активируется в начале этого процесса. Этот ген невозможно транскрибировать in vitro той формой РНК-полимеразы, которая активна в вегетативной фазе развития. Однако его удается протранскрибировать ферментом, содержащим вместо белок с мол. массой 37000 дальтон. Этот белок называют ст , исходя из предположения, что он способен действовать как новый сигма-фактор, придающий минимальному ферменту способность транскрибировать новые гены. [c.157]

Что вызывает замену одного сигма-фактора другим В вегетативных клетках уже присутствует а , хотя он и не связан с минимальным ферментом. Поэтому, вероятно, какой-то другой белок, возможно продукт гена spoO, непосредственно участвует в замене или же модифицирует минимальный фермент, повышая его сродство к При этом мутация в любом из пяти генов spoO может блокировать экспрессию генов, специфичных для ранних стадий процесса споруляции, которые обычно транскрибируются 2 ферментом. Поэтому замена на может представлять собою весьма сложный процесс. Не исключено также, что эта замена происходит только у части молекул РНК-полимераз, так как некото- [c.157]

Через 4 ч после начала споруляции в клетках впервые появляется другая форма фермента. Она содержит белок с мол. массой 29000 дальтон, ассоциированный с обычным минимальным ферментом. Новый белок, обозначаемый придает способность минимальному ферменту транскрибировать in vitro новые гены. По крайней мере в одном из spoO-мутантов не синтезируется. Поэтому можно думать, что рассматриваемый белок является продуктом гена, участвующего в споруляции на ранней стадии и необходимого для включения следую- [c.158]

Когда в системе in vitro определенные транскрипционные единицы используются в качестве матриц для синтеза РНК, правильной терминации не происходит. Минимальный фермент может на некоторое время остановиться на терминаторе, но затем продолжит транскрипцию, наращивая цепь РНК до тех пор, пока какие-либо случайные события не заставят его отделиться от [c.162]

Открытие антитерминации как фагоспецифического механизма помогло обнаружить другие бактериальные белки, являющиеся компонентами транскрипционного аппарата. Бактериальные белки, с которыми взаимодействует белок pN в процессе функционирования, могут быть выявлены с помощью мутантов Е. соН, в которых белок pN не может обеспечить антитерминацию. Эти мутанты резистентны к инфицированию фагом лямбда, так как в этих клетках фаг способен экспрессировать только свои предранние гены. Некоторые из этих мутаций картируются в гене гроВ. Это свидетельствует в пользу того, что белок pN взаимодействует с (3-субъединицей минимального фермента. [c.171]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология