Векторы нестабильность

Фаговые векторы. Космиды. ВАС- и YA -векторы. Векторы на основе бактериальных плазмид широко используются для клонирования, но у них есть один важный недостаток — небольшая емкость. В таких векторах можно клонировать фрагменты в среднем не более 7—8 т. н. п., а последовательности эукариотических генов гораздо длиннее (в среднем IО—25 т. н. п). Кроме того, для изучения регуляторных последовательностей, находящихся за пределами кодирующей части генов, необходимо клонировать еще более протяженные области генома. Оказалось, что для клонирования таких фрагментов плазмидные векторы не подходят. Дело в том, что плазмиды, содержащие большие вставки хромосомной ДНК (более 8 т. н. п.), нестабильны и при репликации постепенно уменьшаются в размере в результате делеций нуклеотидов чужеродной ДНК. [c.40]

Ретровирусные векторы имеют тот серьезный недостаток, что все они генетически нестабильны. Это может проявляться либо в форме массированных делеций, которые легко обнаруживаются с помощью блот-гибридизационного анализа, либо в виде точ-ковых мутаций, которые труднее детектировать и потому они более коварны. По всей видимости, РНК-полимераза и обратная транскриптаза, реплицирующие вирусный геном, не обладают сколько-нибудь заметной корректирующей активностью и частота спонтанных мутаций у ретровирусов необычайно высока [14, 20]. По имеющимся оценкам, частота мутирования ретровирусных векторов достигает 0,5% в расчете на каждый цикл [c.304]

Изучение функции центромер в составе гибридных плазмид имеет определенные ограничения. Оно не позволяет выявить тонкие дефекты функций центромер, поскольку такие плазмиды гораздо менее стабильны в митозе по сравнению с природными хромосомами. Поэтому важен подход, основанный на введении в состав хромосом измененных центромерных участков, инактивации природной центромеры или замены ее на другую. Инактивации центромерного локуса в составе хромосомы можно добиться встройкой в этот локус интегративного вектора, несущего нефункциональный гомологичный центромерный локус. Хромосома с инактивированной центромерой становится крайне нестабильной. Стабилизировать такую хромосому можно, введя в ее состав через другой интегративный вектор новую центромеру. Центромера при этом может быть включена не в центромерный локус хромосомы, а в другой участок. Более того, интегрируемая центромера может быть гетерологичной, т. е. от другой хромосомы. Последнее, в частности, указывает на [c.304]

Кроме явных преимуществ ретровирусы как молекулярные векторы имеют и тот недостаток, что они относительно нестабильны генетически. По имеющимся оценкам, частота мутирования ретровирусов и их гибридных вариантов достигает 0,5 % в расчете на цикл репликации. Это связано, по-видимому, с низкой корректирующей активностью (или ее полным отсутствием) у ферментов ревертазы и РНК-полимеразы, реплицирующих вирусный геном. [c.408]

Конструирование челночного вектора связано с решением специфических проблем, поскольку одна его часть всегда является чужой , а другая- род-ной в альтернативных хозяйских клетках. Чужая часть не должна мешать репликации, направляемой родной частью вектора. Не следует конструировать векторы с таким сочетанием последовательностей, при котором он становится нестабильным в одном из двух хозяев, как это происходит при наличии последовательностей, мешающих реплика- [c.251]

Последнее соотношение показывает, что возмущения скорости нормальны к волновому вектору. Таким образом, полученные-решения выражают поперечные волны, не вызывающие отклонений от равномерного распределения порозности. В то же время,, волны, соответствующие решению уравнения (111,39), вызывают конечные флуктуации порозности и могут рассматриваться как волны сжатия . Основной целью анализа устойчивости системы является обнаружение нестабильностей, которые приводят к колебаниям порозности, предшествующим образованию газовых пузырей в слое. По этой причине первоочередное внимание уделено видам колебаний, соответствующим решению уравненйя [c.89]

Плазмидные векторы, несущие ютонирован-ные со -гены, часто оказываются нестабильными в В. thuringiensis даже в отсутствие селективного давления все они или их часть утрачиваются. Интересно, что при этом в природе большинство [c.338]

Дислокации с полым ядром представляют исключение из правила, согласно которому дислокации с большим вектором Бургерса нестабильны и распадаются на составляющие дислокации с мень-ши.м вектором 1эургерса. [c.30]

Вследствие универсальности генетического кода определенная кодирующая последовательность всегда будет содержать одну и ту же информацию. (Единственное исключение-митохондриальные гены, где имеются отличия в генетическом коде, как описано в гл. 4.) Поэтому при встраивании в вектор интактной последовательности, кодирующей эукариотический белок, возможна транскрипция этой последовательности с образованием мРНК, которая может транслироваться в бактерии-хозяине. Единственные отличия состоят в том, что в синтезированном белке могут отсутствовать модификации, имеющиеся в природном клеточном белке, и, конечно, всегда существует риск, что полипептидная цепь в бактериальной клетке окажется нестабильной. Однако при наличии в клетке подходящих условий любая эукариотическая последовательность может быть транслирована с образованием соответствующего белка. [c.244]

Для рекомбинационного картирования требуется клетка реципиента с кольцевой ДНК хромосомы и ДНК донорной клетки. ДНК клетки-донора может вводиться в клетку реципиента различными способами с помощью Hfr-хромосомы (при коньюгации), вместе с фагом-вектором (трансдукция), или путем прямой передачи ДНК из клетки донора в клетку-реципиент, как это описано в гл. 4 в отношении пневмококков (трансформация). Образующаяся при этом частично диплоидная клетка называется мерозиготой. Мерозиготы нестабильны, поскольку донорная ДНК представляет собой фрагмент целого репликона. Генетические [c.246]

Для того чтобы избежать нестабильности плазмиды вследствие экспрессии кДНК (см. п. 4 выше), необходимо пользоваться сильным, но жестко регулируемым промотором (полностью репрессируемым в нормальных условиях). Для достижения той же цели следует также ввести в вектор сигнал термп-нации транскрипции. [c.50]

Основным недостатком плазмидных векторов для клонирования является их малая емкость в отношении клонируемых фрагментов ДНК. Размер вставок клонируемой ДНК в плазмидных векторах, которые способны стабильно в них существовать, как правило, не превышает нескольких тысяч пар оснований. Большие вставки ДНК в векторных плазмидах нестабильны, и их размеры постепенно уменьшаются по мере увеличения числа раундов репликации таких рекомбинантных плазмид in vivo. Выраженное делетирование чужеродной ДНК в плазмидах большого размера связано с тем, что в бактериальных клетках селективное преимущество получают те плазмиды, время репликации которых минимально. Поэтому нуклеотидные последовательности ДНК, не участвующие в репликации векторных плазмид, постепенно элиминируются посредством делеций при длительном культивировании рекомбинантных бактерий. [c.80]

Использование YA для получения клонотек нуклеотидных последовательностей. При создании искусственных хромосом дрожжей in vitro в среднем удается клонировать фрагменты ДНК длиной 300 т.п.о. Однако с помощью гомологичной рекомбинации, проводимой непосредственно в клетках дрожжей, можно получать вышеупомянутые вставки в несколько млн п.о. Для реализации полной емкости вектора используют предварительно полученные YA -конструкции, в которых клонированы частично перекрывающиеся последовательности. Для обнаружения перекрывающихся клонов используют рестрикционное картирование с гибридизацией по Саузерну, метод прогулки по хромосоме и ряд других стандартных методов исследования генома, которые будут рассмотрены во втором томе этой книги. После обнаружения таких перекрывающихся клонов проводят скрещивание гаплоидных клеток, содержащих требуемые YA , в полученных диплоидных штаммах индуцируют мейоз, при котором с высокой частотой возникают требуемые рекомбинантные YA с протяженными непрерывными последовательностями - контигами - исследуемого генома. Для предотвращения образования в результате рекомбинации дицент-рических и ацентрических YA , которые нестабильны, объединяемые вставки должны быть клонированы в одной и той же 5 3 -ориентации по отношению к маркерам вектора. После завершения клетками мейотических делений и споруляции в спорах обнаруживают требуемые рекомбинанты, конечная длина которых после проведения серии последовательных скрещиваний может превышать 2 млн п.о. [105, в]. [c.91]

Способы работы с векторами YA описаны в гл 11. Здесь же отметим нестабильность получаемых с их помощью клонов. Например. в геномной энциклопедии Б. subtilis в 10 % клонов были отмечены перестройки (Azevedo et al., 1993). [c.276]

Аденовирусные векторы первого поколения (с делецией локуса El, см. с. 404) сохранили поздние гены, кодирующие структурные белки. Это является еще одной причиной их нестабильности. Введенные в организм клетки с вирусными белками воспринимаются как чужеродные и постепенно элиминируются иммунной системой. Эти факты говорят о том, что аденовирусные векгоры больше подходят для терапии рака, где достаточно временной экспрессии терапевтических генов, чем для исправления наследственных дефектов. [c.424]

Однако все эти векторы и векторные системы имеют существенный недостаток. Поскольку проведение подобных делеционных процедур требует использования специальных штаммов Е. oli и весьма сложной схемы их выращивания, это служит некоторым препятствием к их широкому использованию. Другими отрицательными моментами, особенно для векторов, рассчитанных на клонирование крупных фрагментов ДНК, являются некоторая нестабильность вставки, трудности в ее реориентации, вызванной необходимостью читать другую цепь ДНК. Также для большинства транспозонов характерным является сосредоточение мест их внедрения у дистального конца вставки по сравнению со значительно меньшей частотой данных событий в центральной и проксимальной частях [Ahmed, Podemski, 1997]. [c.298]

Многие бактериальные молекулярные векторы основаны на высоко- или среднекопийных репликонах, которым часто свойственна структурная нестабильность встроенных фрагментов (см. гл. 8), сопровождаемая делегированием или перестройкой сегментов клонированных фрагментов ДНК. Особенно такая нестабильность характерна для протяженных фрагментов ДНК эукариотических организмов, поскольку они могут содержать различные семейства повторяющихся последовательностей. [c.108]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология