Выделение из генома индивидуальных генов

Выделение из генома индивидуальных генов [c.242]

Достижения генной инженерии, сделавшей возможным выделение и клонирование индивидуальных генов, а также изучение первичной структуры ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции, методов секвенирования (см. гл. 15) сильно поколебали представления об универсальности структуры гена. Теория гена вступила в очередной критический период. [c.476]

Для выделения и исследования более длинных генов или группы соседних генов с прилежащими к ним последовательностями необходимо клонировать фрагменты ДНК еще большей длины (30—45 т. н. п.). Для клонирования таких фрагментов были сконструированы специальные векторы с большей емкостью — космиды, представляющие собой гибридную молекулу, содержащую специальный os-участок генома фага, за счет чего они могут упаковываться в головку фага X, и специальные последовательности, позволяющие им реплицироваться по плазмидному типу. Размер космиды довольно мал по сравнению с фаговым вектором — всего 5 т. н. п. и, следовательно, в космиду можно вставить чужеродную ДНК значительных размеров (30—45 т. н. п.). Фаговые головки, содержащие такую рекомбинантную ДНК, не могут размножаться как фаги. Ими трансформируют клетки Е. соИ. Гибридная молекула, содержащая эукариотическую ДНК, обрамленную os-сайтами, размножается в Ё. соИ как плазмида, и каждая фаговая частица вызывает образование колонии индивидуального бактериального трансформанта [c.41]

Реассоциация двух комплементарных последовательностей ДНК происходит путем спаривания оснований-в отличие от процесса денатурации, при котором они разделяются (см. рис. 2.15). Мы уже рассмотрели многие эксперименты, в основе которых лежит использование этого метод для выделения индивидуальных последовательностей ДНК или РНК и их способности гибридизоваться со специфическим зондом. Сейчас мы увидим, что кинетика реассоциации отражает разнообразие присутствующих в клетке последовательностей, причем эта реакция может быть использована для определения количества генов и их РНК-продуктов. Такие реакции при их проведении в растворе называются гибридизацией в растворе. [c.224]

Комплекс карбамида был впервые получен в 1940 г. Бен-геном [3], установившим, что алифатические соединения с прямой цепью, содержащие шесть и более атомов углерода, легко образуют с карбамидом кристаллические комплексы, а соединения с разветвленной цепью и циклические соединения таких комплексов не образуют. Это открытие стало известно лишь в 1949 г. Вскоре после опубликования Бенгеном своих первых работ [4, 5 и др. 1 появилось большое количество других работ, посвященных теоретическим основам комплексообразования и применению этого метода в нефтеперерабатывающей промышленности для депарафинизации нефтепродуктов и выделения парафина , в жировой промышленности — для разделения жирных кислот в научно-исследовательских работах — для разделения соединений различных классов, для выделения некоторых индивидуальных веществ и т. д. В соответствующих разделах названы имена многих советских и зарубежных ученых и инженеров, внесших свой вклад в разработку теоретических основ процесса карбамидной депарафинизации и внедрение его в промышленность. [c.7]

Методы генной инженерии в сочетании с доступностью ДНК, являющихся копиями мРНК, открыли три возможности а) выделение ранее труднодоступных генов эукариот в индивидуальном виде б) получение их в больших количествах, необходимых для структурного анализа в) создание системы их экспрессии в чужеродных организмах, например в бактериальных клетках. [c.298]

Метод клонирования широко используют для выделения индивидуальных генов прямо из генетического материала, располагая при этом высокоспецифичными радиоактивными РНК- и ДНК-зондами Эти последние взаимодействуют только с определенными последовательностями и гибриды их с генами регистрируются радиоавтографией на рентгеновских пленках Пример анализа по Саузерну (по англ southem-blotting — промокание по Саузерну) показан на рис 67 Аналогичный подход применим и д 1 анализа РНК (метод Нозерн -блотинга) [c.194]

Одно из основных применений техники клонирования-выделение индивидуальных генов непосредственно из генетического материала. Каждый индивидуальный ген представляет собой только очень небольшую часть эукариотического генома. Например, размер генома типичной клетки млекопитающих составляет около 10 п.н., так что один ген размером, скажем, 5000 п. н. составляет только 0,00005% всей ядерной ДНК. Для идентификации столь незначительного количества материала необходимо иметь высокоспецифичный зонд, взаимодействующий только с определенными, интересующими исследователя последовательностями, чтобы выделить их из огромного количества других последовательностей. Обычно применяемый метод состоит в использовании высокомеченых радиоактивных РНК- или ДНК-зондов, гибридизация которых с геном регистрируется с помощью радиоавтографии. [c.242]

Специальные компьютерные прогршлмы позволяют повысить эффективность проведения генно-инженерных разработок путем анализа карт рестрикции ДНК и анализа кодируемых белковых продуктов, оптимизации синтеза фрагментов ДНК различными методами, выбора оптимальных зондов для выделения индивидуальных генов и т.д. Неожиданно полезной оказалась методика сравнения вновь расшифрованных последовательностей со всеми последовательностями банка. При этом были отк- [c.5]

Разработка методов генной инженерии (см. гл. 11) позволила проводить мутагенез in vitro на выделенных индивидуальных генах, изменяя и заменяя участки ДНК по желанию экспериментатора. Такой подход — крупный шаг на пути к направленному изменению генетического материала, однако и он не избавляет от необходимости изучать закономерности мутационного процесса, происходящего в клетке и организме. [c.317]

Следующим щагом в развитии методов химического синтеза генов стало создание специализированных компьютерных программ, которые позволят оптимизировать структуру олигонуклеотидов, чтобы свести к минимуму образование комплексов, приводящих к появлению побочных продуктов. Одним из первых примеров использования такой программы для выявления самокомплементарных и повторяющихся последовательностей оснований служит работа по синтезу гена эпидермального фактора роста, предназначенного для экспрессии в клетках Е. oll. Целевой ген, кодирующий 53 аминокислоты, был разбит на 23 олигонуклеотида. На рис. 1.42 приведен фрагмент составленной с помощью ЭВМ схемы последовательной сборки целевой ДНК из 17 промежуточных блоков-интермедиатов, каждый из которых был выделен в индивидуальном состоянии. Несмотря на оче- [c.63]

Хроматографический анализ — метод разделения гомо генных многокомпонентных систем, основанный на исполь зовании явления сорбции в динамических условиях, был предложен в 1903 г. для выделения индивидуальных ве ществ из раствора их смеси русским ботаником и биохими ком Михаилом Семеновичем Цветом (1872—1919) [1]. Раз деление компонентов системы происходит в процессе про тёкания раствора через хроматографическую колонку наполненную гранулированным или порошкообразным сор бентом, [c.6]

Получение белков в кристаллическом виде не всегда еще 1 арантирует выделение индивидуальных белков, так как иногда несколько близких друг к другу по своим свойствам белковых веществ кристаллизуются вместе с образованием кристаллов общей для них формы. В этих случаях кристаллические белки представляют собою смеси или комплексы, состоящие из нескольких индивидуальных белков. Так, например, установлено, чтс> кристаллический миоген, выделенный из мышц, включает несколько индивидуальных белков. Неоднородными по своему химическому составу ока зались кристаллический р-глобулин молока и некоторые иные препараты кристаллических белков. Неоднородность состава препаратов кристаллических белков устанавливается физико-химическими методами (например, методом электрофореза, ультрацентрифугированием), а также изучением их биологических особенностей. Так, например, установлено, что кристаллический миоген обладает активностью нескольких ферментов. Учитывая специфичность действия ферментов, следует считать, что кристаллы мио-гена представлены не одним всего, а несколькими индивидуальными белками. [c.35]

Была исследована кинетика гибридизации индивидуальных мРНК, соответствующих некоторым генам наиболее интересные результаты получены для а- и (3-глобиновых генов нескольких видов млекопитающих. Полученные данные обычно указывают на существование одной или двух копий каждого гена. На самом деле эти данные дают заниженную оценку числа сходных последовательностей в геноме, поскольку в экспериментах по прямому выделению генов часто обнаруживаются дополнительные сходные с ними последовательности (гл. 21). [c.231]

Первые указания на то, что в системе репликации ДНК участвует целый ряд важных генетических функций, были получены благодаря выделению широкого набора условно-летальных температурочувствительных мутантов Е. соН (dna ), комплементационный анализ которых позволил соотнести их с мутациями в ряде различных генов. Среди них можно выделить два класса мутантов, которые при рестриктивной температуре (1) немедленно прекращают синтез ДНК или (2) в течение относительно протяженного временного интервала постепенно прекращают синтезировать ДНК (рис. 13.5). Первый фенотип связан с нарушением процесса синтеза ДНК в репликативной вилке, а второй-с исчезновением способности инициировать новый цикл репликации хромосомы. (В несинхронизированной культуре индивидуальные клетки мутантов второго класса, находящиеся на различных стадиях репликации, начавшейся еще при пермиссивной температуре, не прекращают синтезировать ДНК после повышения температуры до полного завершения цикла репликации хромосомы.) После сопоставления выделенных мутаций с определенными белками, на которых сказываются эти мутации, можно начать изучение функциональной роли этих белков in vivo. Локализация генов, ответственных за репликацию ДНК, на хромосоме Е. соИ показана на рис. 13.6. [c.112]

Таким образом, различные химические и физические воздействия, ведущие к возникновению новых молекулярных форм, должны, по-видимому, осуществляться на более ранних стадиях секреции. Среди возможных причин образования множественных форм целлюлаз — наличие подлинных изоферментов, кодируемых отдельными генами и выполняющих различные функции, неодинаковые способы сплайсинга мРНК, транскрибируемых с одного гена, комплексирование с индивидуальными углеводными компонентами, ассоциация белков и диссоциация надмолекулярных образований, модификация ферментного белка протеолити-ческимп ферментами и, наконец, воздействие физико-химических факторов среды при соответствующих условиях культивирования микроорганизма-продуцента. Множественность компонентов, кроме того, может выступать как артефакт в процессе выделения ферментов (Рабинович,1987). [c.47]

Быстрое, и даже бурное развитие протеомики в последние несколько лет определяет интенсивное использование в исследовательской работе рекомбинантных белков. Естественно, работа с индивидуальными белками требует их эффективной очистки. Как всегда, любая задача может быть решена разными способами. Использование для быстрого выделения индивидуальных белков аффинной метки (affinity tag) в виде специфической аминокислотной последовательности, присоединенной к одному из концов исследуемого полипептида, позволяет просто и эффективно решать эту задачу [156]. Присоединение аффинных последовательностей проводят методами генной инженерии, объединяя в составе экспрессируюш,его вектора кодируюш,ую часть исследуемого гена с последовательностью нуклеотидов того или иного пептида или полипептида, обладаюш,его избирательным сродством к лиганду (табл. 5). В целом, системы очистки рекомбинантных белков, основанные на аффинных аминокислотных последовательностях, обладают целым рядом уникальных свойств. Так, они позволяют проводить выделение любого гибридного белка в один этап путем его адсорбции на соответствующем носителе. Сама аффинная метка оказывает минимальное влияние на третичную структуру основного белка и может быть легко удалена из гибридного полипептида. Кроме того, она допускает проведение быстрой и точной количественной оценки содержания белка в искусственных системах экспрессии рекомбинантных генов. Тем не менее использование каждой аффинной метки требует соблюдения конкретных условий, которые не являются универсальными и могут оказывать сильное влияние на биохимические свойства выделяемого белка. [c.124]

Определив последовательность нескольких N-концевых аминокислот белка, можно в соответствии с генетическим кодом синтезировать ряд олигонуклеотидных зондов и использовать их для скрининга клонотеки генов. В этом случае удобнее использовать экспрессирующую клонотеку кДНК, так как для получения необходимой информации нужно будет исследовать меньшее количество клонов. Действительно, в клонотеках кДНК отсутствует большинство некодирующих последовательностей нуклеотидов, суммарная длина которых может значительно (на два-три порядка) превышать таковую значимых последовательностей. Однако при использовании таких клонотек особенно остро встает вопрос об их репрезентативности, поскольку внутриклеточное содержание индивидуальных мРНК сильно различается в клетках разных тканей. После выделения рекомбинантной ДНК, гибридизующей-ся с упомянутыми выше олигонуклеотидными зондами, можно [c.251]

А. Вигцоровиц с соавторами (1999 г.) расширили возможности использования TMV для продукции субъединичных вакцин. Они создали вектор на основе ДНК-копии РНК TMV, обеспечивающий синтез индивидуальных чужеродных белков в большом количестве. Авторы встроили полилинкер сразу после субгеномного промотора гена СР (рис. 19.11) для встройки и экспрессии под его контролем чужеродных генов. Для обеспечения нормальной продукции вирусного белка СР после полилинкера поместили второй гомологичный субгеномный промотор, выделенный из генома другого штамма [c.477]