Радиоавтографии метод

Очень важной областью применения радиоавтографии является обнаружение радиоактивного ДНК-зонда после его гибридизации с препаратом ДНК, подвергнутым электрофоретическому разделению. К сожалению, провести гибридизацию в самом геле невозможно, поскольку зонд не может в него проникнуть. Поэтому ДНК после электрофореза переносят на нитроцеллюлозный или найлоновый фильтр по методу Саузерна (Саузерн-блоттинг) или с помощью элюции. Расположение молекул ДНК на фильтре в точности соответствует таковому в геле. Перенесенную на фильтр ДНК подвергают [c.65]

В данной работе описаны два подобных опыта с применением количест венной радиоавтографии. Метод был использован для сравнения только средних количеств радиоактивного материала на единицу площади образцов. Однако при проведении этой работы стало очевидным, что радиоавтография обладает такими возможностями, которые заслуживают более широкого внимания. [c.243]

На практике наличие радиа ции устанавливается при помощи специальных приборов (счетчиков излучения) или же фотографическим путем —метод радиоавтографии (греческое слово автограф по-русски обозначает написанный собственной рукой ). Этот метод основан на том, что радиоактивное излучение действует на светочувствительный слой фотопластинки в темноте. [c.391]

Применение радиоактивных изотопов, т. е. хроматографирование смеси, один или несколько компонентов которой являются радиоактивными, облегчает задачу качественного анализа. Пятно на хроматограмме, содержащее радиоактивный компонент, можно обнаружить счетчиком Гейгера— Мюллера, либо методом радиоавтографии. Этот метод заключается в том, что бумажная хроматограмма, содержащая радиоактивный изотоп, контактирует некоторое время со светочувствительной пленкой или бумагой, после проявления которых наличие радиоизотопа легко обнаруживается по почернению того места, которое соответствует положению пятна радиоизотопа на первичной хроматограмме. Методом радиоавтографии можно обнаруживать любое неорганическое или органическое вещество, молекула которого содержит радиоизотоп. [c.124]

Нерадиоактивные методы детекции В большинстве лабораторий для гибридизации используют зонды, меченные каким-либо радиоактивным изотопом, чаще всего Р. Такие зонды обладают высокой удельной радиоактивностью и обеспечивают хорошее отношение сигнал/шум. Радиоактивно меченный зонд наносят на фильтр с фиксированной на нем ДНК-мишенью, проводят гибридизацию, отмывают несвязавшуюся ДНК-зонд и детектируют метку с помощью радиоавтографии. [c.190]

Если нельзя подобрать реактивы, образующие окрашенные в разные цвета пятна компонентов разделяемой смеси, или использовать методы люминесценции и радиоавтографии, применяют метод свидетелей . Он основан на том, что коэффициент Я) не зависит от присутствия посторонних веществ. Поэтому, если параллельно с каплей анализируемой смеси на полоску хроматографической бумаги нанести каплю смеси, содержащей известные вещества, то после проявления хроматограммы можно, сравнивая положение пятен компонентов анализируемой смеси с положением пятен известных соединений, идентифицировать не- известные вещества. [c.124]

Радионуклиды, попадая в биосферу, вызывают многочисленные экологические последствия (табл. 49). В результате поверхностного стока радионуклиды могут скапливаться в понижениях, ложбинах и других аккумулятивных элементах рельефа. Нуклиды поступают в растения и энергично мигрируют по пищевым цепям. Почвенные микроорганизмы аккумулируют радиоактивные элементы, что хорошо обнаруживается методом радиоавтографии. На этом принципе разрабатываются методы идентификации микробных популяций для диагностики геохимических провинций с высоким содержанием радионуклидов. [c.157]

Этот метод широко применяется для локализации радиоактивного материала в клетке, срезе ткани или на пластине геля после электрофореза смеси макромолекул. Для регистрации радиоактивных зон на исследуемый образец накладывают рентгеновскую пленку, в которой под действием радиоактивного излучения из бромида серебра образуется металлическое серебро. Засвеченные участки, соответствующие радиоактивным зонам, наблюдаются визуально после проявления пленки. Одним из вариантов радиоавтографии является флюорография. В этом случае в исследуемый образец импрегнируют сцинтиллятор и вновь накладывают рентгеновскую пленку. Метод основан на том, что низкоэнергетические Р-частицы, образующиеся при распаде изотопа (например, трития), взаимодействуют с молекулами сцинтиллятора, при [c.65]

Часто необходимо обнаружить на хроматограммах соединения, содержащие различные радиоизотопы, а также дважды меченные вещества [5, 27]. Это легко осуществить методом радиоавтографии, если два изотопных элемента значительно отличаются по периоду полураспада или по жесткости -излучения. [c.68]

Реакция проходит как по остаткам цитозина, так и по остаткам тимина. Однако в щелочной среде (0,1М КОН в гидразингидрате) реакция по дезокситимидиновым фрагментам подавляется и модификация проходит только по остаткам дезокси-цитидина. Это позволяет получить картину распределения остатков обоих пиримидиновых нуклеотидов и отдельно — дезоксицитидиновых звеньев. Этой информации достаточно, чтобы определить положение раздельно по каждому из пиримидиновых нуклеотидов. На рис. 78 приведены радиоавтограф геля, полученного методом Максама — Гилберта, и прочитываемая по этому гелю последовательность секвенированного полинуклеотида. [c.280]

Присутствие в органическом соединении небольших количеств радиоактивных побочных продуктов или продуктов распада невозможно установить ни при помощи классических критериев степени химической чистоты [ЮЗ], ни в результате использования обычных химических и физических тестов. Хотя радиоактивные загрязнения составляют небольшую часть общего количества вещества, однако они могут составлять значительную долю общей радиоактивности. Наиболее подходящим способом определения изотопной чистоты соединения является разделение исследуемого препарата при помощи какого-либо хроматографического метода на химически чистые фракции с последующим определением содержания в них радиоактивных изотопов. Наиболее удобным способом является, вообще говоря, бумажная хроматография в сочетании с радиоавтографией [104—107]. Если на рентгеновской пленке обнаруживается только одно пятно, то это указывает на высокую степень изотопной чистоты исследуемого образца. Очевидные преимущества этого метода состоят в чувствительности и экономии вещества, а также в возможности оценки самопроизвольного распада путем сравнения радиоавтографов, полученных в разное время [108—ПО]. [c.30]

Совершенно очевидно, что перед использованием хранившихся в течение длительного времени соединений с высокой удельной активностью необходимо проверять, не подверглись ли они распаду. Наиболее удобным общим методом установления наличия радиоактивных примесей является разделительная хроматография на фильтровальной бумаге с последующей радиоавтографией. Летучие компоненты следует улавливать и превращать в удобные для исследования менее летучие производные [109, 148]. [c.33]

Этот метод можно также применять для разделения неорганических ионов. Для передачи электрического тока требуется наличие фонового электролита. Примером является разделение бария и лантана, а также радия, свинца и висмута, проводимое в 0,1 М растворе молочной кислоты при градиенте потенциала 3,5 в на 1 сж [40]. За 24 ч радий передвинулся на 100 см, барий — на 90 см, свинец — на 50 см и висмут— от 10 до 15 см. Положение ионов было определено методом радиоавтограф ий при помощи естественной радиоактивности и введенных индикаторов. Методом электрохроматографии оказалось возможным отделить литий от натрия и от других щелочных металлов в растворе цитрата аммония [15]. [c.261]

Для обнаружения радиоактивных веществ на пластинке чаще всего используют метод радиоавтографии. Недавно была предложена [67] интересная комбинация хроматографической камеры со счетчиком Гейгера—Мюллера в качестве детектора для счета радиоактивных частиц при анализе радиоактивных соединении на тонкослойных хроматограммах. [c.47]

Для обнаружения пятен веществ, обладающих радиоактивным излучением, применяется метод радиоавтографии. После испарения растворителя со слоя к нему плотно прикладывается фоточув-ствительная пленка или бумага, выдерживается некоторое время и проявляется. Время выдержки определяется чувствительностью-фотоматериала и интенсивностью излучения. После проявления на пленке или бумаге обнаруживаются черные пятна, соответствующие радиоактивным веществам. [c.147]

Спустя несколько лет Кернс исследовал процесс репликации непосредственно, использовав метод радиоавтографии ДНК с применением тимидина, меченного радиоактивным изотопом водорода — тритием ( Н) [25]. Клетки Е.соИ выращивали на среде, содержащей Н-тимидин, в течение разных промежутков времени, но в типичном опыте — около [c.196]

Сравнительно новым методом маркировки редуцирующих концов углеводных цепей является восстановление альдегидных групп бортри-тидом натрия (ЫаВШ4). Введенная таким способом радиоактивная метка дает возможность по радиоавтографам хроматограмм определять положение фрагментов, отщепленных от редуцирующих концов. [c.177]

Ключевую роль в этом исследовании сыграло сочетание методов двухмерной хроматографии на бумаге и радиоавтографии (дополнение 2-В). Суспензия водоросли hlorella (рис. [c.477]

Какие способы позволяют наблюдать и изучать in situ клеточные белки Мы увидим далее, что сохранение белков и их макромолекулярной архитектоники вследствие участия белков во всех клеточных структурах составляет первостепенную проблему для цитологов. Последовательно рассмотрим цитологические и цитохимические приемы, используемые при световой микроскопии, а затем при электронной микроскопии классическую фиксацию, ультракриотомию, криовытравливание (низкотемпературное травление). Мы увидим также, что может дать для изучения белков применение новейших цитологических методов, таких, как иммуноцитохимия и радиоавтография. Далее мы попытаемся подвести итоги современных знаний о структуре и ультраструктуре запасных белков, об их генезисе и эволюции в клетках, будь то кристаллические протеины или белковые тельца. [c.126]

Чтобы изучить образование белков в динамике и установить, например, изменения белковых структур в процессе их хранения, можно ввести в органы или ткани предшественник белка, меченный тритием или углеродом " С, и с помощью радиоавтографии выявлять радиоактивные соединения. При световой и электронной микроскопии биологический материал обрабатывают с таким расчетом, чтобы получить тонкие или сверхтонкие срезы, которые затем покрывают подвижной ядерной эмульсией, как, например, эмульсия Ильфорсд Г5 или Л4 (1Иог5с1 Оз или Ь4) по методу Ларра и Дроза [52]. После удаления эмульсии местонахождение радиоактивных участков определяется по присутствию зерен восстановленного серебра, которые задерживают фотоны или электроны. - [c.128]

С помощью методов радиоавтографии [6, 17] или иммуно-цитохимии [26, 27, 11, 67] удалось определить места на шероховатой эндоплазматической сети (ШЭС), где происходит синтез запасных белков семян. Белки, синтезированные на полирибосомах, связанных с ШЕС, сразу проходят через мембрану сети благодаря наличию на N-конце полипептидов с гидрофобными свойствами короткой последовательности, называемой сигнальной [15, 45]. Существование такой последовательности в настоящее время установлено у бобовых и злаковых [18, 23, 32]. При появлении (в просвете эндоплазматической сети) этой последовательности она отделяется от новосинтезированной цепи специфической пептидазой. В процессе прохождения через мембраны шероховатой эндоплазматической сети некоторые белки могут также становиться гликоксилированными [62, 5, 65]. Таким образом, механизм анаболизма запасных белков очень сходен с механизмами, описанными для секреторных клеток животных [70] и растений [46]. [c.135]

Фотографические методы основаны на измерении почернения фотографических пластинок или пленок под действием радиоактивного излучения или на наблюдении в фотоэмульсии треков отдельных частиц, испускаемых радиоактивным препаратом. При действии ионизирующих излучений на фотоэмульсию в зернах AgBr образуются центры скрытого изображения, что при проявлении вызывает почернение эмульсии в месте прохождения частицы (образование треков ). В зависимости от рода излучений, действие которых на фотоэмульсию неодинаково по интенсивности, различают а-, р-, у-радиографические измерения. Методом радиографии решаются следующие задачи идентификация радиоактивных изотопов, определение их концентрации, измерение периода полураспада, оценка радиохимической чистоты препарата, получение картины распределения радиоактивного изотопа по поверхности образца (радиоавтография). При этом обычно применяют тонкослойные пластинки и специальные эмульсии, созданные для целей ядерной физики. Если не рассматриваются треки отдельных частиц, определение интенсивности излучения заключается в сравнении почернения эмульсии исследуемого образца и препарата с известной активностью (эталона) под действием [c.163]

Рис. 45. Очистка радиоактивного трипальмитина методом ХТС [39]. Денси-тометрические кривые радиоавтографов тонкослойных хроматограмм продажного — —) и очищенного --) трипальиититга.

Очень часто для решения биотехнологических и некоторых других задач бывает необходимо знать полную нуклеотидную последовательность клонированного гена. Для секвенирования используют несколько методов один из них - ди-дезокси-метод, разработанный Сангером и др. В его основе лежит остановка синтеза цепи после присоединения к ней дидезоксинуклеотида. У такого нуклеотида отсутствует 3 "-гидроксильная группа, и дальнейший рост цепи становится невозможным. Для секвенирования в разных пробирках одновременно проводят четыре реакции синтеза ДНК, каждая - в присутствии одного из четырех дидезоксинуклеотидов. Продукты реакций разделяют с помощью гель-электрофореза, проводят радиоавтографию и считывают с радиоавтографа нуклеотидную последовательность синтезированного фрагмента ДНК. [c.103]

Из меристематических клеток стеблей бобов выделен макро-молекулярный комплекс, состоящий из ксилоглюкана и целлюлозы [26]. Препарат был выделен путем последовательной экстракции образца этанолом, буферным раствором с pH 7,0 и 4%-ным раствором КОН в присутствии 0,1 7о МаВН4. Остаток представлял собой комплекс целлюлоза—ксилоглюкан и не содержал протеина и ароматических соединений, но сохранял как бы начальную форму этой полимерной композиции, характерной для клеточной стенки. В этой работе [26] был использован широкий арсенал современных методов исследования электронная микроскопия на оттененной поверхности образца световая микроскопия, сопряженная с радиоавтографией, выявляющей фукозу с меченым атомом водорода, и флюоресцентная микроскопия, которая обнаруживает соединение фукозы или галактозы с флюоресцирующим [c.150]

Рис. 78. Радиоавтограф геля, полученного методом Максама-Ги.пберта, А и прочитываемая по этому гелю последовательность секвенированного с О-участка кДНК-фрагмента генома вируса клещевого энцефалита ("по дан- ным А.Г. Плетнева) "

Таким образом, для полного анализа последовательности любого полинуклеотида необходимо иметь, во-первых, метод получения четырех наборов специфических концевых продуктов, подобных тем, которые приведены втаблице 12, и, во-вторых, метод, позволяющий проводить сравнение длин этих продуктов. Различие современных методов анализа заключается в способах получения наборов специфических фрагментов. Общность — в способе сравнения длин, которое во всех случаях производится путем электрофореза радиоактивных концевых продуктов в пластинках полиакриламидного геля. По окончании электрофореза положение продуктов в геле определяют путем радиоавтографии. Каждый продукт проявляется в виде темной полосы на рентгеновской пленке сравниваются относительные подвижности полос в разных дорожках, подобно тому как сравнивались длины продуктов в таблице I. Картина распределения полос на рисунке 180 соответствует последовательностн олигонуклеотидов в таблице 12. Это следует нз анализа относительных подвижностей продуктов самый подвижный и, следовательно, самый короткий продукт обнаруживается в дорожке С, следующий по подвижности н длине — в колонке Т, далее — в колонке С, следующие два — в колонках Т и А соответственно и т. д. Выписывая таким образом названия колонок в порядке, в котором в них обнаруживаются последовательно удлиняющиеся продукты, получают формулу исходного олигонуклеотида. [c.321]

Рнс. 2j.l. Метод радиоавтографии в при мснении к поиску рекомбинантных клонов. [c.435]

Аналогичным образом можно обнаружить одновременно с 8 или [27, 28, 63, 65]. Алюминиевая фольга толщиной < 0,1 мм экранирует мягкое излучение радиоактивной серы и углерода, в то время как излучение радиоиода с большой энергией легко проходит через тонкие слои алюминия. Радиоавтографы хроматограмм на бумаге и хроматограмм в тонких слоях могут быть количественно промерены фотоденситометрически или по величине пятна. Возможности этого метода анализа будут нами рассмотрены ниже. [c.69]

В большинстве случаев для радиохимических исследований необходимо лишь несколько миллиграмм меченого соединения. Такие небольшие количества легко выделить методом ХТС. Мангольд, Камерек и Малинз [39] использовали ХТС для анализа и очистки липидов, меченных С , и 1 . На рис. 44 показан радиоавтограф тонкослойной хроматограммы имеющихся в продаже различных жирных кислот, меченных в карбоксильной группе. [c.72]

Если необходимо очистить количество в несколько грамм, то выгоднее использовать колоночную хроматографию. На рйс. 46 показан радиоавтограф тонкослойной хроматограммы меченого триолеин (глицерилтридииодо-9, 10-Р -стеарат) до и после очистки методом колоночной хроматографии. [c.72]

Туна, Камерек и Мангольд [62], применив индикаторный анализ, показали, что фракции природных липидов, разделенные методом ХТС, не загрязняют друг друга. Небольшие количества горячего трипальмитина были смешаны с жиром печени акулы и затем разделены методом адсорбционной ХТС. Радиоавтограф хроматограммы показал, что вся ра иоактивность находится во фракции триглицеридов. Весьма близкие по структуре к триглицеридам алкоксидиглицериды не были ими загрязнены (см. рис. 72, стр. 152). [c.74]

Реже применяемыми реактивами для опрыскивания (гл. 23) являются растворы бромтимолового синего, фосфомолибденовой кислоты, треххлористой сурьмы, пятихлористой сурьмы, а-циклодекстрина с парами иода,, флуоресцеина с парами брома и гидроксиламина с хлоридом трехвалентного железа. Липиды, которые благодаря наличию системы сопряженных двойных связей поглощают УФ-свет, можно обнаружить в УФ-свете на слоях силшса-геля Г, содержащих флуоресцирующие вещества. Гидроксил- или аминосодержащие липиды следует хроматографировать в виде меченых радиоактивных ацетильных производных, жирные кислоты — в виде радиоактивных метиловых эфиров. Радиоактивные производные липидов локализуют методом радиоавтографии (см. стр. 67). [c.154]

Вещество, оказавшееся однородным после применения различных методов хроматографического разделения, можно рассматривать как хроматографически чистое . На рис. 44 приведен радиоавтограф тонкослойной хроматограммы меченых жирных кислот. Фирма-изготовитель указала, что чистота каждой такой кислоты была подтверждена методом газовой хроматографии. Рис. 44 показывает, однако, что ати продажные препараты, все без исключения, представляют собой смеси. Почти все загрязнения — промежуточные продукты синтеза этих кислот — более полярны, чем сами жирные кислоты. Они, по-видимому, застревают в газохроматографической колонке и не регистрируются в элюате. [c.181]

Метод клонирования широко используют для выделения индивидуальных генов прямо из генетического материала, располагая при этом высокоспецифичными радиоактивными РНК- и ДНК-зондами Эти последние взаимодействуют только с определенными последовательностями и гибриды их с генами регистрируются радиоавтографией на рентгеновских пленках Пример анализа по Саузерну (по англ southem-blotting — промокание по Саузерну) показан на рис 67 Аналогичный подход применим и д 1 анализа РНК (метод Нозерн -блотинга) [c.194]

В работах с мечением белков флуоресцеином для их обнаружения показана однородность распределения белков в геле. Однако Дэвид и др. [15], которые исследовали распределение белка методом радиоавтографии Ч-меченой перокспдазы, связанной с сефарозой, не обнаружили связывания фермента внутри гранул сефарозы. Лаш и др. [46] нашли, что расхождения объясняются не методами обнаружения белка, а разными методами его иммобилизации. Используя электронную микроскопию ферритииа, связанного с сефарозой, они продемонстрировали, что использование очень эффективного метода связывания, а именно большого избытка ферритина в ходе связывания (>50 мг/мл), с эффективностью связывания >90% приводит к вогнутой кривой распределения ковалентно связанного ферритина, в то время как при эффективности связывания >50% наблюдается снова однородное распределение связанного ферритина. [c.256]

Как полагают, при генетической рекомбинации в области каждого кроссинговера происходит синтез некоторого количества ДНК. Метод радиоавтографии в сочетании с электронной микроскопией позволяет показать, что радиоактивные предшественники включаются в пахитенную ДНК главным образом в области рекомбинационных узелков или поблизости от них. [c.25]

Такой же метод радиоавтографии был использован при изучении развития колонок глазодоминантности (главным образом у кошек и обезьян). В самый ранний период жизни животного никаких колонок различить ие удается проекции двух сетчаток всюду перекрываются, и каждая область зрительной коры получает информацию от обоих глаз. Лишь позднее (обычно в первые недели жизни) эти проекции разделяются на чередующиеся полоски таким образом, что нейроны двух соседних полосок получают ббльшую часть информации от разных глаз. Это служит еще одним примером первоначального перепроизводства синапсов с последующей ликвидацией излишка, когда перекрывающиеся группы аксонных окончаний распределяются по разным участкам. Есть некоторые расхождения в мнениях о том, насколько этот этап развития зависит от зрительного восприятия однако точно установлено, что даже после того, как колонки глазодоминантности образовались, существует период, когда отсутствие Зрительных стимулов может привести к нх разрушению, как это показано в эксперименте, описанном ннже. [c.151]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология