Равновесное связывание лигандов с макромолекулами

Определение равновесного связывания лиганда с макромолекулами, как правило, дает число молей лиганда, связанных с одним молем макромолекул. Этот параметр обычно обозначается V н определяется следующим соотношением [c.9]

Хилл рассмотрел модель с максимальной кооператив-ностью, т. е. когда связывание первого лиганда увеличивает сродство остальных центров настолько, что. они заполняются практически мгновенно. Это предположение эквивалентно тому, что в любой равновесной смеси лиганда ( ) и макромолекул, имеющих п идентичных центров связывания, присутствуют в значительных концентрациях либо только макромолекулы с незанятыми центрами связывания (М), либо комплексы лиганда с макромолекулой (М1 п)г где все центры заполнены. Для реакции практически одновременного присоединения п лигандов М Ч--Ь ч= г МЬа константа связывания (К) определяется выражением [c.81]

Взаимодействия макромолекул с лигандами широко распространены в биохимических системах. Для анализа равновесных свойств разнообразных систем разработан обширный и удобный математический аппарат. При таком анализе очень важно учитывать различие между микроскопическими и макроскопическими константами и связанные с этим статистические особенности систем. В простейших системах лиганды связываются в идентичных независимых центрах одного типа такие системы удобно анализировать, используя график Скэтчарда. Модифицированный метод анализа с использованием графиков Скэтчарда может быть полезен и в случае связывания лиганда с макромолекулой, имеющей независимые центры нескольких типов. [c.38]

Некоторые методы позволяют регистрировать только свободные лиганды. Например, при потенциометрическом титровании раствора pH соответствует концентрации свободных протонов (Н" ). Количество связанных протонов можно найти из соотношения (23.74), поскольку количество добавленных в раствор протонов известно. Эквивалентными методами для ионов металлов являются кондуктометрическое титрование или методы, основанные на использовании специфических ионных электродов. Многими методами можно регистрировать лишь связанные лиганды. Сюда относятся всевозможные методы, основанные как на исследовании биохимических эффектов, так и на изменении в результате связывания физико-химических свойств макромолекул (таких, как кажущаяся молекулярная масса, плавучая плотность, вязкость и спектроскопические свойства макромолекул). Они могут быть использованы для регистрации равновесного связывания, но [c.362]

Равновесный диализ является обычным методом измерения связывания малых молекул (лигандов) с макромолекулами. В ходе диализа лиганд проходит через мембрану в отделение, содержащее макромолекулы, и его концентрация снижается за счет связывания с последними [87, 101, 102]. По уменьшению концентрации лиганда (например, НАД) и по известной концентрации макромолекул (например, фермента) можно рассчитать число связывающих участков и константу диссоциации комплекса фермент — кофермент. Объемы внутреннего и внешнего отделений аппарата для диализа должны быть очень точно известны и проверены на удобной контрольной системе. Этот метод был использован, например, при исследовании связывания НАД+ с глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназой мышц кролика [90]. [c.408]

В простом случае идентичных и независимых центров уравнение (15.29), в которое входят величины V и (Ь), является особенно удобным для анализа экспериментальных данных. График зависимости р/(Ъ) от V называют иногда графиком Скэтчарда (см. 8са1сЬагс1, 1949). Эта зависимость является линейной наклон соответствующей прямой равен —к , и она отсекает на оси ординат отрезок, равный по величине п/к, а на оси абсцисс отрезок, равный л, как показало на рис. 15.1. Таким образом, построение подобного графика дает простой и удобный способ определения двух параметров, характеризующих равновесное связывание лигандов с макромолекулами. [c.12]

Мы рассмотрим сначала статистические основы процесса связывания, с тем чтобы иметь возможность проанализировать и понять принципиальные свойства равновесных систем, в которых происходят связывание лигандов. Параду с общими соображениями, применимыми к любой равновесной системе, мы встретимся и с множеством особенностей, таких, как взаимодействие связывающих центров и кооператнвность, взаимоотношения между двумя различными лигандами при связывании с одной макромолекулой, статистические осложнения при связывании лигандов с линейными кристаллоподобными структурами. [c.6]

Ограниченная диффузия возникает, если молекулярная диффузия в порах матрицы затруднена из-за экранирования подхода макромолекул к прикрепленному аффинному лиганду. Экспериментально вклад этой диффузии можно определить с большим трудом, но для аффинной хроматографии на очень пористых носителях эти трудности становятся минимальными. На практике для достижения равновесных условий желательно, чтобы скорость потока была по возможности низкой. Например, при скорости потока 400 мл/ч для выделения стафилококковой нуклеазы на колонке объемом 20 мл небольшие количества нуклеазы появлялись в первом пике вместе с белковыми примесями, особенно если общая концентрация белков в образце была высока (20—30 мг/мл) [5]. Однако даже при такой высокой скорости потока нуклеаза полностью сорбировалась, если наносился менее концентрированный образец. Зависимость связывания лактатдегидрогеназы на №-(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозе от скорости потока пссле-дована Лоу и др. [21]. Было найдено, что увеличение скорости потока относительно мало влияет на сорбцию. При высоких скоростях потока эффективность колонки (ВЭТТ), а также связываемость р уменьшаются. Влияние скорости потока более заметно в небольших колонках, с которых часть белка с ферментативной активностью элюируется со свободным объемом. Влияния концентрации инертного белка (бычьего сывороточного альбумина) при высоких скоростях потока (67 мл/ч) также не обнаружено. [c.84]