Связывание лигандов с макромолекулами

График, имеющий вид вогнутой кривой, может быть обусловлен либо отрицательной кооперативностью связывания лиганда, либо существованием на макромолекуле участков связывания с различными константами диссоциации. В случае положительной кооперативности при связывании лиганда график имеет вид выпуклой кривой. [c.343]

Это уравнение показывает, что, по крайней мере в принципе, время корреляции можно определить, если известны q и / (Тс) для свободных ионов, а 6), рассчитано, исходя из s. Полученное таким путем время корреляции отражает взаимодействие между ионами металла и водой в некоторых случаях его можно использовать и применительно к другим лигандам. Величина Sb может зависеть от окружения металла, поскольку на эту величину могут влиять изменения гидратационного числа q или т , а следовательно, и /i(T ). Такие эффекты могут быть обусловлены связыванием лигандов с макромолекулами, поэтому измерение скорости релаксации протонов воды в присутствии комплекса с фермен- [c.385]

СВЯЗЫВАНИЕ ЛИГАНДОВ С МАКРОМОЛЕКУЛАМИ [c.78]

Образование комплексов между малой молекулой (ионом, метаболитом, гормоном, лекарственным препаратом и др.), именуемой лигандом ( ) и центрами связывания лиганда на макромолекуле (М) лежит в основе функционирования многих биополимеров. Образование комплекса МЬ можно рассматривать как химическую реакцию М -Ь + МЬ, характеризуемую константой образования комплекса, т. е. константой связывания (К) [c.78]

Меньший эффект скорости потока наблюдается для пленочных носителей (рис. 5) [7]. Влияние скорости потока также менее заметно в случае взаимодействий лиганд — макромолекула с высокими константами ассоциации. Однако в некоторых системах с высоким сродством (например, иммуноглобулин — антиген) может иметь место необратимое связывание, если белки контактировали с гелем в течение длительного времени. Как правило, с колонкой следует работать настолько быстро, на- [c.108]

Прежде чем рассматривать связывание лигандов с многочисленными центрами макромолекул, обсудим кратко различие между микроскопическими и макроскопическими константами равновесия. Рассмотрим это на конкретном примере титрования глицина, который можно считать двухосновной аминокислотой. Обозначим формы глицина, содержащие два протона, один протон и не содержащие ни одного протона, соответственно через СН СН и С , гота макроскопические равновесия можно записать следующим образом [c.6]

Рассмотрим макромолекулу М, которая содержит п центров связывания лиганда Ь. Все центры характеризуются одной и той же микроскопической константой диссоциа- [c.8]

Определение равновесного связывания лиганда с макромолекулами, как правило, дает число молей лиганда, связанных с одним молем макромолекул. Этот параметр обычно обозначается V н определяется следующим соотношением [c.9]

Уравнения (15.28) и (15.29), простые по форме, можно вывести, и не прибегая к статистическим представлениям. Однако приведенный вывод полезен для понимания статистических особенностей равновесий при связывании лигандов с макромолекулами. [c.11]

Кооперативное связывание лигандов с макромолекулами рассматривалось многими авторами. Некоторые аспекты анализа, проведенного ими, и отдельные модели кооперативности обсуждаются в гл. 17. В этом разделе, однако, имеет смысл рассмотреть основные характеристики взаимодействий такого типа. [c.17]

При анализе процессов кооперативного связывания лигандов с макромолекулой обычно используют полуэмпирический подход для определения параметров связывания, а затем объясняют их физический смысл. Полуэмпирический метод основан на предположении, что связывание в пределах части области насыщения описывается уравнениями, феноменологически похожими на уравнения для случая систем с высокой степенью кооперативности. В крайнем случае — бесконечно высокой степени кооперативности — связывание может быть представлено как реакция, протекающая по принципу все или ничего [c.18]

Взаимодействия макромолекул с лигандами широко распространены в биохимических системах. Для анализа равновесных свойств разнообразных систем разработан обширный и удобный математический аппарат. При таком анализе очень важно учитывать различие между микроскопическими и макроскопическими константами и связанные с этим статистические особенности систем. В простейших системах лиганды связываются в идентичных независимых центрах одного типа такие системы удобно анализировать, используя график Скэтчарда. Модифицированный метод анализа с использованием графиков Скэтчарда может быть полезен и в случае связывания лиганда с макромолекулой, имеющей независимые центры нескольких типов. [c.38]

Во многих биологических системах при связывании лиганда одного сорта с макромолекулой имеет место взаимодействие центров. Обычно обнаруживают кооперативные взаимодействия между центрами, и их можно проанализировать разработанными методами. Другим типом взаимодействия является взаимодействие между центрами одной и той же макромолекулы, в которых связываются лиганды разного сорта. В этом случае особенно интересны и полезны уравнения, описывающие взаимное влияние лигандов на их связывание. Энергия взаимодействия, характеризующая такое влияние, обычно составляет от О до л 2,5 ккал/моль. [c.38]

Рассмотрите случай связывания с макромолекулой двух лигандов, Ь, и 1 2- Пусть половина Ь,-связывающих и, Ь2-связывающих центров заполнены. Используя уравнения (15.89) и (15.90), выведите уравнения (15.91), (15.92) и (15.93). [c.39]

Существует несколько основных кандидатов на роль иона — вторичного посредника в клетке. Сульфат, бикарбонат и фосфат — очень крупные многоатомные анионы, а анион хлора обладает сравнительно большим радиусом и несет, к тому же, всего один заряд. Поэтому эти анионы не способны к прочному связыванию с макромолекулами, в частности с белками. Калий также имеет относительно большой ионный радиус. Ион натрия, хотя и обладает радиусом, близким радиусу иона кальция (соответственно 0,102 и 0,100 нм при координационном числе 6), но, как и ион калия, однозаряден. Большие размеры анионов и единичный заряд у калия и натрия, по-видимому, затрудняют формирование достаточно прочных их связей с белковыми лигандами. [c.15]

Чтобы правильно выбрать лиганд, нужно хорошо знать специфичность подлежащих очистке макромолекул. Лиганд должен содержать определенную химическую группу, которая не участвует в специфическом связывании лиганда с макромолекулой, но посредством которой происходит его сшивание с матрицей. Чтобы в процессе сшивания с матрицей не нарушалась способность лиганда связываться с макромолекулой, целесообразно связывать лиганд с матрицей с помощью удлиняющих мостиков . [c.102]

Когда взаимодействуют две молекулы, распределение электронов в одной молекуле может влиять на химические сдвиги ядер другой. Если ядро находится в полимере, проявляется взаимное влияние различных участков или остатков, которые отдалены в цепи полимера, но находятся по соседству в трехмерном пространстве. Иначе говоря, при свертывании молекулы и формировании третичной структуры полимера могут оказаться сближенными удаленные химические группы, в результате чего создается новое окружение ядер и изменяются химические сдвиги эти изменения могут быть меньше тех, которые наблюдались вследствие внутримолекулярных эффектов, описанных в предыдущем разделе. Межмолекулярные эффекты имеют большое значение для биохимии, так как с их помощью можно контролировать связывание лиганда с макромолекулой (например, взаимодействия между ферментом, кофактором и субстратом) и описать пространственную структуру участка полимера. [c.488]

Связывание лиганда с участком макромолекулы обычно оказывает влияние как на спектр лиганда так и на спектр макромолекулы. Хотя такие факторы, как перераспределение локального заряда, изменения в ориентации групп, находящихся на расстоянии от места связывания, и т. д. могут приводить к спектральным изменениям, во многих случаях их причиной являются ядра, расположенные в месте связывания. Обычно наблюдается смещение линии, сопровождаемое ее уширением, так как в участке связывания, вероятно, понижается свобода движения ядер. [c.496]

Для получения надежных величин к необходимо, чтобы удовлетворялись некоторые условия I) неспецифическое связывание лиганда и макромолекулы с самим диализным мешком должно быть небольшим и, лучше всего, поддающимся измерению 2) связывание должно быть сильным, иначе из-за ниже описываемого эффекта возможно получение отрицательного связывания (что, конечно, пе имеет смысла). Этот эффект состоит в следующем при больших концентрациях достаточно крупных макромолекул их объем составляет относительно большую долю внутренней части диализного мешка, и, если макромолекулы не связывают лиганд, его концентрация внутри диализного мешка окажется заметно меньше внешней концентрации лиганда, так как он может свободно распределяться не во всем внутреннем объеме, а лишь в части его, не занятой макромолекулами. Следовательно, связывание должно быть всегда достаточно большим, чтобы можно было пренебречь этим отрицательным эффектом. [c.524]

Участки связывания характеризуются одинаковыми величинами микроскопической константы ассоциации комплекса белок — лиганд. Таким образом, для первой молекулы лиганда существует равная вероятность взаимодействия с любым из центров связывания (на рис. 45 макромолекула схематически изображена в виде квадрата с четырьмя [c.345]

С первого взгляда может показаться, что уравнение (4-17) (уравнение Эдера) полностью описывает процесс связывания, однако, как правило, это не так. Зачастую в макромолекуле имеются центры связывания более чем одного типа, а уравнение (4-17) ничего не говорит нам о характере распределения лиганда X между различными центрами в комплексе РХ. Более того, если п велико, то невозможно экспериментально определить все п констант. Чтобы проанализировать оба вопроса, рассмотрим микроскопические константы связывания. [c.254]

В этом случае все микроскопические константы образования оказываются равными и представляют собой одну истинную константу, относящуюся ко всем центрам связывания. Действительно, уравнение (4-30) совпадает с аналогичным уравнением, описывающим присоединение одного протона (или какого-нибудь другого лиганда) к молекуле, обладающей одним центром связывания. Это согласуется с нашим, уже упоминавшимся выше интуитивным представлением, согласно которому раствор вещества, молекулы которого содержат п независимых центров связывания, должен вести себя точно так же, как в п раз более концентрированный раствор вещества с одним центром на молекулу. Таким образом, все наши расчеты только подтверждают выводы, и так логически вытекающие из физических представлений. Однако в действительности центры связывания в одной макромолекуле редко бывают абсолютно независимыми почти всегда между ними есть какое-то взаимодействие, и для этих случаев вполне применимы уравнения, выведенные нами для определения констант, относящихся к отдельным стадиям процесса связывания, н истинных констант. [c.258]

Состояние равновесия при образовании комплексных ионов с металлами описывается точно так же, как и при связывании малых молекул и ионов с макромолекулами [26—28]. Для образования комплексов, содержащих один, два или большее число лигандов X, связанных с центральным ионом металла, определяются соответствующие констан- [c.263]

Равновесный диализ является обычным методом измерения связывания малых молекул (лигандов) с макромолекулами. В ходе диализа лиганд проходит через мембрану в отделение, содержащее макромолекулы, и его концентрация снижается за счет связывания с последними [87, 101, 102]. По уменьшению концентрации лиганда (например, НАД) и по известной концентрации макромолекул (например, фермента) можно рассчитать число связывающих участков и константу диссоциации комплекса фермент — кофермент. Объемы внутреннего и внешнего отделений аппарата для диализа должны быть очень точно известны и проверены на удобной контрольной системе. Этот метод был использован, например, при исследовании связывания НАД+ с глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназой мышц кролика [90]. [c.408]

Стереоспецифичность связывания бенздиазепинов с ЧСА характерна для гемисукцината оксазепама (СХ). Интересно отметить, что стереоспецифичностью связывания обычно обладают лиганды, имеющие несколько участков связывания на макромолекуле, например варфарин, барбитураты, азокрасители и др. Для них сродство к альбумину незначительно. Гемисукцинат оксазепама — первое соединение, обладающее большой стереоспецифичностью и сродством к молекуле ЧСА [336]. Методами гельфильтрации и кругового дихроизма установлено, что соединение СХ, имеющее 8-конфигурацию, в 40 раз превышает сродство К-энантиомера к альбумину. Такая высокая стереоспецифичность характерна только для Ь-триптофана. На основе эквимолярных концентраций триптофана и 1,4-бенздиазепинов найдено, что последние вытесняют триптофан из участков связывания на ЧСА. Характер замещения для них конкурентный [c.238]

Предельно совершенным решением эволюционной задачи создания молекулярного механизма перемещения в пространстве будет предельно возможное уменьшение паразитного объема, переход к созданию локальной концентрации лиганда в активном центре макромолекулы, изменяющей свою конформацию при связывании лиганда. Для обеспечения не просто периодичности, а выполнения полезной работы связываемый лиганд должен расщепляться на одной из стадий циклического процесса в экзэргонической реакции. [c.171]

При проведении аффинного элюирования необходимо учитывать некоторые аспекты взаимодействия лиганд — макромолекула. Увеличение концентрации соли может значительно уменьшить биоспецифическое взаимодействие, но может также ослабить последующее взаимодействие со свободным лигандом при аффинном элюировании. Увеличение концентрации соли уменьшает неспецифические ионные взаимодействия, но может также усиливать гидрофобные взаимодействия, особенно при наличии на сорбенте полиметиленовых вставок. Если важную роль при связывании играют гидрофобные взаимодействия, то более эффективным может быть уменьшение концентрации соли. Кроме того, можно использовать изменение pH или введение агентов, уменьшающих поверхностное натяжение (для ослабления гидрофобных и вандерваальсовых взаимодействий). В качестве последних могут применяться неионный детергент, такой, как тритон Х-100 до 1%-ной (об./об.) концентрации в буфере, зтиленгликоль [10—50% (об./об.)] или относительно небольшие количества этанола [до 5% (об./об.)]. Маловероятно, чтобы эти вещества могли вызывать изменения константы ассоциации с заряженными лигандами. После предварительного уравновешивания колонки указанным буфером в него вводят лиганд для аффинного элюирования. Очевидно, могут быть использованы также аллостерические модифицирующие агенты или ингибиторы взаимодействия лиганд — макромолекула, причем приведенное выше обсуждение по применению свободного лиганда полностью относится и к указанным агентам. [c.114]

Мы рассмотрим сначала статистические основы процесса связывания, с тем чтобы иметь возможность проанализировать и понять принципиальные свойства равновесных систем, в которых происходят связывание лигандов. Параду с общими соображениями, применимыми к любой равновесной системе, мы встретимся и с множеством особенностей, таких, как взаимодействие связывающих центров и кооператнвность, взаимоотношения между двумя различными лигандами при связывании с одной макромолекулой, статистические осложнения при связывании лигандов с линейными кристаллоподобными структурами. [c.6]

В простом случае идентичных и независимых центров уравнение (15.29), в которое входят величины V и (Ь), является особенно удобным для анализа экспериментальных данных. График зависимости р/(Ъ) от V называют иногда графиком Скэтчарда (см. 8са1сЬагс1, 1949). Эта зависимость является линейной наклон соответствующей прямой равен —к , и она отсекает на оси ординат отрезок, равный по величине п/к, а на оси абсцисс отрезок, равный л, как показало на рис. 15.1. Таким образом, построение подобного графика дает простой и удобный способ определения двух параметров, характеризующих равновесное связывание лигандов с макромолекулами. [c.12]

До сих пор мы обсуждали только те случаи, когда с макромолекулой связьшаются лиганды одного сорта. Однако на практике встречаются ситуации, когда необходимо рассматривать одновременное связывание с макромолекулой двух различных лигандов. Одним из примеров такой ситуации является влияние pH на связывание лиганда. В этом случае протонирование одного или нескольких критических центров макромолекулы тесно связано с присоединением к ней лиганда. [c.21]

Имеется целый ряд интересных и полезных соотношений, описывающих взаимозависимые равновесия для процесса связывания с макромолекулой двух разных лигандов. Прн их анализе мы будем придерживаться пути, разработанного Уайменом (Wyman, 1964). Начнем опять с рассмотрения связывания молекул одного лиганда L в л центрах махрс-молекулы М. Здесь мы будем использовать математический аппарат, несколько отличающийся от изложенного ранее он удобен, в частности, для анализа взаимозависимых равновесий. [c.21]

Величина л ( у предстшляет собой изменение числа центров макромолекулы, занятых Ь,, а — л /у, = ,)] — изменение числа свободных центров связывания Ь,. Поэтому левая часть уравнения (15.70) отражает изменение числа свободных центров связывания Ь, (или числа молей высвободившегося Ь,) при связывании моля лиганда Ъ2- Ясно, что число молей высвободившегося лиганда может быть положительным или отрицательным (отрицательное число сответствует связыванию лиганда). [c.24]

Когда ДО 2 = -2 ккал/моль, 2 у 2 > 0,8 когда ДО 2 = -3 ккал/моль, 2jT,2 > 0,9. В последнем случае более 90Ч о связанных L, и Lj находятся в форме LjML,. В этом примере при связывании лигандов образуется в основном форма LjML, и в незначительных количествах — формы ML, и L M. И наоборот, когда ДО 2 = + 2 или + 3 ккал/моль, в области полунасыщения больщая часть связанных лигандов находится в виде форм ML, и LjM. Таким образом, энергия взаимодействия, составляющая по величине только около 2 ккал/моль, является достаточной, чтобы вызвать значительное изменение распределения форм макромолекулы, содержащих связанные лиганды, по сравнению со статистическим. [c.30]

Макромолекула имеет шесть центров связывания лиганда Ь. Исследователь может определить три макроскопические константы диссоциации, характеризующие связывание лиганда, К .К и Ку Он нашел, что = 15 /Г, и = 8/Г,. Ои утверждает, что этот результат ясно показывает отрицательное (антикооперативное) взаимодействие между центрами и что график Скэтчарда для этой системы, несомненно, представляет собой выпуклую кривую. Оппонент не соглашается с исследователем и говорит, что имеющиеся данные указывают на отсутствие взаимодействия между центрами и что он попытается предсказать относительные значения К. для других констант. Кто иэ них прав и почему Можно ли предсказать значения других X. Если да, то сделайте это. Если нет, то объясните, почему нельзя предсказать значения других констант. [c.39]

При использовании белков в качестве лигандов о выборе точки закрепления в большинстве случаев не может идти речи — таких точек, как правило, на поверхности белка много. К счастью, биологическая, и в частности ферментативная, активность белка нередко сохраняется ири фиксации его в разных точках, если при этом активный центр белковой макромолекулы остается экснонированным. Разумеется, для некоторой доли молекул фермента точка связывания может оказаться в активном центре или вблизи него, что помешает взаимодействию с ним субстрата. Этим, в частности, обусловлено снижение суммарной активности при закреплении ферментов на матрицах. [c.386]

Взаимодействие малых молекул с биологическими макромолекулами и модельными соединениями также интенсивно изучается в термодинамике растворов. В монографической и периодической литературе достаточно подробно представлены такие аспекты данной проблемы, как кислотно-основные равновесия в белках, связывание гемоглобином и миоглобином газообразных лигандов (кислород, монооксид углерода), взаимодействие катионов с белками и нуклеиновыми кислотами. Многие из низкомолекулярных полярных неэлектролитов являются компонентами биологических жидкостей или подобны мономерным единицам биомакромолекул. [c.5]

Из конформационной лабильности макромолекулы белка следует специфическое взаимодействие фермента с субстратом и другими лигандами. Возможно, что в некоторых конформациях белок более эффективно связывает субстрат, чем в других. При связывании может происходить отбор конформаций субстрата. Каруш объяснил способность альбумина плазмы связывать различные вещества конфигурационной адаитабильностью этого белка [63]. [c.387]

Связывание актиномицина и АК идет ступенчато, через ряд промежуточных форм. Комплексообразование меняет конформацию ДНК. Рентгенографическое исследование показало, что ДНК в комплексе с профлавином имеет больший щаг спирали, чем у свободной ДНК и частично раскручивается [139]. Опыты со сверхскрученной (зирегсоИес ) кольцевой ДНК показали, что -В присутствии АК и актиномицина она раскручивается [140,, 141]. В такой ДНК основная правая спираль закручена в правую спираль более высокого порядка. Раскручивание сверхскрученной ДНК при образовании комплекса приводит вследствие топологических особенностей кольцевой структуры самой ДНК к изменениям геометрии всей макромолекулы. Установлено существование критической концентрации лиганда, отвечающей полному раскручиванию сверхспирали дальнейшее добавление красителя вызывает закручивание ДНК в обратном направлении с образованием левой сверхспирали. Эти факты обнаруживаются методом седиментации. [c.528]

Ограниченная диффузия возникает, если молекулярная диффузия в порах матрицы затруднена из-за экранирования подхода макромолекул к прикрепленному аффинному лиганду. Экспериментально вклад этой диффузии можно определить с большим трудом, но для аффинной хроматографии на очень пористых носителях эти трудности становятся минимальными. На практике для достижения равновесных условий желательно, чтобы скорость потока была по возможности низкой. Например, при скорости потока 400 мл/ч для выделения стафилококковой нуклеазы на колонке объемом 20 мл небольшие количества нуклеазы появлялись в первом пике вместе с белковыми примесями, особенно если общая концентрация белков в образце была высока (20—30 мг/мл) [5]. Однако даже при такой высокой скорости потока нуклеаза полностью сорбировалась, если наносился менее концентрированный образец. Зависимость связывания лактатдегидрогеназы на №-(6-аминогексил)-5 -АМР — сефарозе от скорости потока пссле-дована Лоу и др. [21]. Было найдено, что увеличение скорости потока относительно мало влияет на сорбцию. При высоких скоростях потока эффективность колонки (ВЭТТ), а также связываемость р уменьшаются. Влияние скорости потока более заметно в небольших колонках, с которых часть белка с ферментативной активностью элюируется со свободным объемом. Влияния концентрации инертного белка (бычьего сывороточного альбумина) при высоких скоростях потока (67 мл/ч) также не обнаружено. [c.84]

В этот обзор включены также аффинные лиганды с очень узкой специфичностью. Например, если к носителю прикрепить ингибитор, специфичный для единственного фермента, образующийся сорбент также будет специфичен только для данного фермента. Однако для использования специфических лигандов необходимо проводить различные и часто очень трудоемкие синтезы сорбента для каждого разделения. Не все аффинанты, которые подходят для комплементарного связывания макромолекул, имеют также подходящие функциональные группы для их прикрепления к нерастворимому носителю. Эти группы долл ны быть предварительно введены в аффинный лиганд, так же как и подходящей длины пространственная ножка , необходихмая главным образом для низкомолекулярных аффинных лигандов (она позволяет осуществлять их специфические взаимодействия с сорбируемым веществом). Практическая полезность специфических сорбентов возрастает, если для их приготовления вместо узко специфических лигандов использо-вать так называемый общий лиганд [37]. Очевидно, что матрица с групповой специфичностью, содержащая общий лиганд, проявляет аффинность к большой группе биологических макромолекул. Например, ферменты метаболизма аспарагиновой кислоты обнаруживают групповую специфическую [c.104]

Избирательное выделение биологически активных макромолекул аффинной хроматографией основано на обратимых взаимодействиях между имхмо билизованным аффинным лигандом и свободной макромолекулой. Однако принцип аффинной хроматографии может быть также использован даже с сорбентом, который содержит необратимый ингибитор, когда после сорбции комплементарной макромолекулы в специфическом комплексе образуется ковалентная связь. Для освобождения выделяемого вещества из комплекса с аффинным сор бентом используют подходящую химическую реакцию. Пример ковалентной аффинной хроматографии— выделение ацетилхолинэстеразы с помощью иммобилизованных органофосфатов [1, 56]. Ацетилхолинэстераза принадлежит сериновым эстеразам, для которых типично ингибирование связыванием с органофосфатами или органофосфонатными эфирами, содержащими легко отщепляемую группу, например, [c.158]

Другим методом аффинной хроматографии, использующим образование специфического комплекса макромолекулы выделяемого вещества с аффинным лигандом, является биоспецифическое элюирование с неспецифических сорбентов этот метод известен как аффинное элюирование и в некоторых случаях как специфическое элюирование субстратом [54]. В основе метода лежит неспецифичеакое связывание, например, слмеси ферментов полимером, который несет на себе функциональные группы, взаимодействующие с ферментами. Требуемый фермент затем специфически элюируют растворол субстрата, ингибитора или какого-либо другого аффинного лиганда. [c.160]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология