Секвенирование одноцепочечных фрагментов ДНК

Первый метод секвенирования ДНК, предложенный Ф. Сэнгером и А. Коулсоном в 1975 г, основан на ферментативных реакциях и носит название плюс-минус -метод. Данный подход предполагает выделение одноцепочечного фрагмента ДНК, соответствующего исследуемому участку генома. Этот фрагмент используют затем в реакции полимеразного копирования в качестве матрицы, а в качестве праймера — синтетические олигонуклеотиды или природные субфрагменты, получаемые после гидролиза определенными рестриктазами. [c.36]

Секвенирование одноцепочечных фрагментов ДНК [c.186]

Для определения последовательности нуклеотидов в ДНК было создано несколько методов. Во всех этих методах ферменты рестрикции используются для фиксации специфических точек отсчета . Последовательность нуклеотидов определяют в одноцепочечных фрагментах, состоящих из 100-200 нуклеотидов. Более длинные последовательности составляются из коротких фрагментов с частично перекрывающимися концами. При секвенировании комплементарной цепи проверяется правильность описания последовательности нуклеотидов в первой цепи. [c.273]

Все методы определения последовательности нуклеотидов основаны на создании исходного набора одноцепочечных фрагментов ДНК, начинающихся в определенной точке и оканчивающихся определенным нуклеотидом, тогда как размеры фрагментов могут быть различны. Каждый такой исходный набор фрагментов затем фракционируют по размерам посредством электрофореза в геле. Фрагменты должны быть помечены радиоактивным изотопом, для того чтобы их размер можно было определять путем радиоавтографии геля. Принципы секвенирования изображены схематически на рис. 9.8. [c.273]

Секвенирование ДНК по Сэнгеру. Это наиболее употребительный метод секвенирования ДНК, поскольку по сравнению с химическим методом он позволяет анализировать более крупные фрагменты ДНК с меньшей вероятностью ошибки. Секвенируемую ДНК сначала клонируют в одноцепочечный бактериофаговый вектор, который может функционировать в Е. соН. Чаще всего используют фаг М13 и его производные [13]. Одноцепочечная ДНК взаимодействует как субстрат с ДНК-поли-меразой, которая точно копирует первую цепь. Однако если нормальный дезокси-нуклеозидфосфат заменить его аналогом-дидезоксинуклеозидфосфатом, то дальнейшее функционирование полимеразы прекращается и рост синтезируемой цепи останавливается. Для инициирования этого процесса используют химически синтезированный универсальный нуклеотидный праймер. Реакцию проводят в присутствии четырех аналогов dNTP, один из которых содержит метку Р. Исходно имеется четыре реакционные смеси, в каждой из которых понижена концентрация одного из аналогов меченого нуклеотида. Поэтому в результате реакции получаются смеси меченных радионуклидами фрагментов ДНК, один конец у которых одинаков, но при этом они имеют разную длину и разные основания на другом конце. После инкубации ДНК в каждой смеси превращается в одноцепочечную форму. Затем смеси подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле. Длину и последовательность фрагментов ДНК можно считывать непосредственно с гелевого слоя. Этот метод позволяет секвенировать в одной серии реакции от 250 до 500 пар оснований. Полученные данные часто анализируют с помощью компьютера. [c.95]

Для секвенирования используют также систему на основе фага М13. В ДНК фага встраивают фрагмент ДНК длиной до 500 нуклеотидов, который хотят секвенировать. Эту рекомбинантную ДНК легко получить в одноцепочечной форме и использовать ее в качестве матрицы для секвенирования вставки. Можно использовать также двухцепочечные плазмиды, содержащие клонированную ДНК. [c.103]

Желание изложить развитие методов молекулярного клонирования небольших фрагментов ДНК и связанного с ним секвенирования ДНК, насколько это возможно, в хронологическом порядке, заставляет на время отвлечься от плазмидных векторов и рассмотреть небольшие одноцепочечные фаговые вектора, тем более, что они оказали, как будет видно из дальнейшего изложения, серьезное влияние на процесс создания последующих поколений векторов. [c.213]

Прежде чем перейти к описанию получения двуцепочечных фрагментов ДНК, несущих единственную метку на одном из концов, все же необходимо упомянуть о Других одноцепочечных фрагментах ДНК, синтезируемых химическим путем, - олигонуклеотидах, точность синтеза которых иногда проверяют секвенированием. Следует отметить, что после мечения 5 -конца синтезированного одноцепочечного олигонуклеотида с помощью полинуклеотидкиназы (причем предварительное дефосфорилирование в данном случае не требуется, так как в результате синтеза 5 -конец олигонуклеотида не несет остатка фосфорной кислоты) образуется сразу пригодный для секвенирования фрагмент ДНК с меткой на одном конце. [c.25]

Описанные выше варианты направленной стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК основаны на особенностях действия используемых ферментов. Так, ДНКаза I в присутствии ионов марганца производит разрыв обеих цепей ДНК с образованием или тупых концов, или с небольшим количеством выступающих нуклеотидов, легко поддающихся репарации. Этот же фермент в присутствии интеркалирующего красителя бромистого этидия делает так называемые ники в виде одиночных разрывов одной цепи ДНК. Специфичная к однонитевой ДНК S1 нуклеаза применяется для разрыва второй цепи ДНК в месте образовавшегося ника или целого участка одноцепочечной ДНК, сформировавшегося после расширения ника с помощью экзонуклеазы III. Для этой же цели используют и другую нуклеазу Ва131, обладающую относительно слабой эндонуклеазной активностью, специфичной для однонитевой ДНК. (Более сильная экзонуклеазная активность этого фермента позволяет деградировать двуцепочечные участки ДНК). Еще один фермент - экзонуклеаза III, используемый вместе с другими ферментами (нуклеазами) в некоторых из упомянутых выше способах для удаления одной цепи ДНК, начиная с ника увеличивает в направлении 3 5 участок одноцепочечной ДНК. [c.256]

МО иметь большое количество идентичных молекул ДНК. Наработку интересующей последовательности можно осушествить клонированием соответствующего фрагмента. Проиллюстрированный на рис. 36.6 метод секвенирования по Максаму-Гилберту основан на химическом расщеплении ДНК по определенному основанию. Другой ферментативный метод—метод Сэнгера—базируется на применении аналогов нуклеотидов, прерывающих синтез комплементарной цепи ДНК по одноцепочечной матрице в месте встраивания в цепь соответствующего аналога. [c.44]

Еще одно неудобство, вызванное прямым секвенированием продуктов ПЦР, обусловлено способностью двух цепей амплифицированного фрагмента к быстрой реассоциации, что мешает отжигу секвенационного праймера на комплементарной последовательности или блокирует реакцию достройки комплекса затравка — матрица. Устранить это препятствие можно, применяя один из вариантов стандартного метода секвенирования двухцепочечной ДНК или модифицируя ПЦР с целью получения одноцепочечных продуктов. [c.185]

Другой способ получения меченного по одному концу фрагмента ДНК также на основе одноцепочечного фага М13 описан другими авторами [Rosenthal et al., 1990]. В данной работе осуществлялся отжиг меченого праймера на одноцепочечной матрице ДНК с таким расчетом, что построение комплементарной цепи с помощью высокопроцессив-ной ДНК-полимеразы приводило, в первую очередь, к копированию вставки, секвенирование которой и предполагалось. [c.32]

Поскольку в основе метода ферментативного секвенирования лежит построение новой комплементарной цепи ДНК по уже имеющейся, то большое значение приобретает подготовка молекул ДНК для осуществления этого процесса. Так, если для метода секвенирования ДНК химической деградацией было необходимо наличие одно- или двуцепочечного фрагмента, нe 5ш eгo на одном (гомогенном) из своих концов единственную метку, то для секвенирования ферментативным методом необходимо наличие немеченной матрицы ДНК и при этом желательно одноцепочечной. Хотя, справедливости ради, следует отметить, что матрица ДНК, несущая какую-либо метку (включая и радиоактивную), в большинстве случаев не окажет заметного влияния на заключительный радиоавтограф из-за большой разницы в размерах самой матрицы и вновь синтезированной в условиях терминации цепи ДНК. Что касается матрицы ДНК, один из концов которой несет метку в виде молекулы биотина, то в этом случае возможна ее сорбция на твердой фазе, например, на магнитных частицах со стрептавидином и проведение так называемого твердофазного секвенирования. При этом выхода биотинилированной метки в заключительный раствор терминирующей смеси, содержащей комплементарную цепь ДНК, меченную уже как-то по-другому и предназначенную для нанесения на секвенирующий гель, даже не произойдет. [c.48]

Был описан интересный способ получения одноцепочечной матрицы ДНК, легший позднее в основу такого высокопроизводительного метода как твердофазное секвенирование (рис. 2.7) [Stahl et al., 1988]. В цитируемой работе фрагмент ДНК, меченный биотином, сорбировался на твердой фазе в виде авидин-агарозы. После этапов денатурации щелочью и последующей отмывки на оставшейся одной цепи ДНК, связанной через биотин-авидиновый комплекс с агарозой, отжигался секвенирующий праймер и шло построение комплементарной цепи ДНК Кленовским фрагментом ДНК-полимеразы в условиях терминации. Затем еще один раунд щелочной денатурации приводил к высвобождению новосинтезированных цепей ДНК, пригодных для их разделения секвенирующим гель-электрофорезом. Справедливости ради следует отметить, что авторы в данной статье упоминают о принципиальной возможности повторения циклов отжига праймера и построения цепи по сорбированной матрице, что [c.56]

Другим подходом для секвенирования ДНК праймерной прогулкой с помощью коротких предсинтезированных праймеров явилось составление 12-, 18- или даже 24-членных праймеров из библиотеки гексануклеотидных фрагментов посредством их лигирования после отжига встык на одноцепочечной матрице ДНК (рис. 2.13) [Szybalski, 1990, 1993]. [c.67]

Своеобразный способ удаления из реакции одной из цепей ДНК, полученной в ходе ПЦР, осуществляется путем ее гибридизации с клонированным ранее в соответствующей ориентации подобным (гомологичным) фрагментом в одноцепочечном векторе М13 [Gal, Hohn, 1990 Gal, 1993, 1996], Причем клонированный фрагмент не должен содержать места отжига амплификационных и секвенирующего праймеров, чтобы не вызывать конкуренцию. В цитируемой работе показано улучшение качества картины секвенируемых полос ДНК после добавления в реакционную среду возрастающих количеств одноцепочечной ДНК вектора М13, несущего вставку, что объясняется одновременным увеличением доступного для ДНК-полимеразы числа копий нужной цепи секвенируемого ПЦР-фрагмента. Однако подобный подход применим только в специальных случаях секвенирования новых членов какого-либо семейства повторяющейся ДНК или гомологичных генов других организмов, поскольку предполагает наличие заранее клонированного участка такого фрагмента ДНК. [c.146]

Интересен способ получения из двуцепочечного ПЦР-продукта одноцепочечной матрицы, пригодной для ее секвенирования обратной транскриптазой [Stoflet et al., 1988]. Особенностью этого метода является то, что матрица представляет собой РНК-копию ПЦР-фрагмента ДНК. Такое становится возможным благодаря специальному праймеру (одному из пары амплификационных), несущему, кроме комплементарной последовательности к секвенируемому фрагменту ДНК, участок промотора фагов Т7, или ТЗ, или SP6 [Lind et al., 1996]. Таким образом, после завершения самой ПЦР в реакционную смесь добавляется фермент Т7 РНК-полимераза, способная за короткий промежуток времени наработать значительное число молекул РНК, представляющих собой, в-данном случае, матрицы для секвенирования (рис. 3.4). [c.147]

Главное отличие циклического секвенирования ДНК от большинства описанных в предыдущем разделе, пожалуй, заключается в особенностях проведения терминирующих реакций. Так, прямое секвенирование фрагментов ДНК, полученных в ходе ПЦР, может проводиться с помощью любой ДНК-полимеразы, включая и нетермостабильную секвеназу. Причиной тому служит весьма значительное количество матрицы ДНК, позволяющей осуществить ее детекцию в секвенирующем геле. А ПЦР в данном случае просто служит для наработки необходимого количества сначала двуцепочечной, а затем и одноцепочечной ДНК. Секвенирование же ДНК с помощью так называемой линейной ПЦР осуществляется посредством циклических этапов денатурации, отжига одного праймера и удлинения цепи в условиях ее терминации дидезоксинуклеотидами, причем последние присутствуют в смеси, начиная с первого цикла (рис. 3.7). Ввиду того, что в этих случаях происходит амплификация ДНК только в арифметической прогрессии (не приводящая даже к образованию полноразмерных продуктов), то исходным материалом, несущим изначально довольно большое число копий секвенируемого фрагмента, может служить, например, ранее клонированная ДНК. С помощью всего 30 циклов становится возможным получение такого количества продуктов реакции амплификации/терминирования, которое уже будет видно после электрофоретического разделения в секвенирующем геле. [c.152]

Система для секвенирования ДНК методом дробовика , основанная на разработанном одноцепочечном векторе, несущем удобный полилинкер, вызвала к жизни способ получения небольших фрагментов ДНК для их последующего клонирования с помощью частощепящих рестрикционных эндонуклеаз с тетрануклеотидными сайтами узнавания (рис. 8.4) [Messing et al., 1981]. Преимуществом этого способа можно считать относительную легкость этапа лигирования при условии использования рестрикционных эндонуклеаз, образующих фрагменты ДНК с липкими концами. Что касается лигирования рестрикционных фрагментов ДНК, несущих тупые концы, то и в этом случае не требовались дополнительные этапы, предшествующие лигированию, в отличие от других методов получения коротких фрагментов ДНК, рассматриваемых ниже. Главный недостаток данного подхода заключается в том, что сайты используемых рестрикционных эндонуклеаз могут быть расположены не очень равномерно и, таким образом, существует вероятность получить какой-нибудь субклон, несущий вставку довольно крупного размера, не позволяющую осуществить ее прочтение за один эксперимент. [c.241]

Смотреть страницы где упоминается термин Секвенирование одноцепочечных фрагментов ДНК: [c.191] [c.208] [c.48] [c.49] [c.145] [c.151] [c.227] [c.230] [c.263] [c.92] [c.108] [c.63] [c.76] [c.108] [c.27] [c.49] [c.140] [c.151] [c.215] [c.216] [c.227] [c.261] [c.265] [c.296] [c.298] [c.325] [c.357]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология