Химотрипсин титрование

Ц. получен с высоким выходом реакцией хлорангидрида коричной кислоты с имидазолом в бензоле при 10—25° [1]. Ц. быстро и количественно реагирует с активным центром а-химотрипсина, поэтому его можно использовать для спектрофотометрического определения концентрации раствора фермента титрованием. [c.227]

Кинетика установления равновесия при взаимодействии а-химотрипсина с Ы-ацетил-Ь-триптофаном. Условия опыта pH 2,3 (цитратный буфер) 25° С ионная сила 0,0Ш [Р о = 5,9410- М. Концентрация свободного фермента определялась титрованием его -нитрофениловым эфиром N-aцeтил-L-тpиnтoфaнa [c.155]

Титрование активного центра химотрипсина, ковалентно связанного с сефадексом 0-200, описано Гейблом [25], который в качестве титрующего агента использовал 4-метилумбеллифернл-п-(К, Ы-триметиламмоний)циннамат (МУТМАЦ). Этот флуорогенный титрующий активные центры реагент позволяет определять даже 0,02 нмоль фермента. [c.252]

Из косвенных методов чаще других используется метод, основанный на изучении рН-зависимости некоторых параметров реакции, таких, например, как максимальная скорость или константа Михаэлиса. Изменение этих параметров в зависимости от pH часто напоминает по своему характеру титрование одной ионизируемой группы (см. гл. VI). Можно поэтому определить соответствующее значение pi a этой группы и попытаться идентифицировать ее путем сравнения полученного значения рЛТ с известным значением p7i для боковых цепей различных аминокислот. Все это сопряжено с известными трудностями. В результате взаимодействия с соседними группами в белке, а также с субстратом или буфером величина pZ для ионизируемой группы в белке может заметно отличаться от соответствующей величины для той же группы, присутствующей в свободном виде в растворе. Кроме того, величины pifa для различных титруемых групп белков в значительной степени перекрываются. Например, группа с pif 10 может быть либо аминогруппой, либо фенольной гидроксильной группой, либо сульфгидрильной группой. В некоторых случаях определение величины A/i ионизации помогает приписать данное значение рЛТ той или иной группе, однако нередко однозначное отнесение полученного значения рЖ к определенной функциональной группе оказывается все же невозможным. Известно также, что рН-зависимость может отражать титрование нескольких остатков, а не какой-либо одной индивидуальной группы. Наконец, крутые перегибы кривых, описывающих зависимость скорости реакции от pH, могут вызываться ие только титрованием, но также и другими факторами, например изменением стадии, лимитирующей скорость реакции. К счастью, все эти ослол<иения возникают не всегда. Часто заключения, сделанные на основании рН-зависимости, удается подкрепить другими методами. Исходя из данных по зависимости максимальной скорости реакции от pH, следует, например, считать, что у всех ферментов, перечисленных в табл. 29, в каталитическом акте участвует остаток гистидина. Для химотрипсина это заключение подтвернодается тем, что соответствующий хлоркетон, являющийся аналогом субстрата химотрипсина, избирательно реагирует с одним остатком гистидина и вызывает таким путем инактивацию фермента. На основании [c.199]

Об активном центре эстераз мы знаем еще довольно мало. Илюется много оснований думать, что наряду с серином в него входит гистидин. Это следует, во-первых, из данных но фотоокис-лительной инактивации ферментов, во-вторых, из зависимости активности фермента от pH. Кривые активности ферментов как функции pH имеют характерную колоколообразную форму. Для сахаразы п трипсина подобные кривые изображены на рис. 50. Их можно истолковать как результат наложения двух кривых титрования. Так, например, можно полагать, что для действия трипсина необходимо, чтобы какая-то группа с р порядка 5—6 и вторая группа с рК 8—9 находились в ионизованном состоянии. Первая группа — кислая, вторая — основная. У химотрипсина [c.149]

Определить с помощью титрования состояние ионизации находящегося в глубине белковой глобулы остатка (например, А8р-102 в химотрипсине и химотрипсиногене) практически невозможно. Из-за высоких фоновых концентраций гидроксил-ионов и протонов точное титрование удается осуществить только в диапазоне pH от 3 до 11. В связи с этим с помощью суммарной кривой титрования нельзя выявить ионизацию групп белка с аномальными р/Са. Например, в химотрипсине имеются три карбоксильные группы с аномально низкими р/Са — они находятся в ионизированной форме при pH < 3. Однако когда белок денатурирован, эти группы титруются нормально, а число титрующихся карбоксильных групп в денатурированном белке можно легко определить. Ионизация А8р-102 химотрипсина и химотрипсиногена при варьировании pH была установлена путем измерения числа поглощенных протонов при денатурации и сопоставления полученного результата с числом ионизированных карбоксильных групп в этих денатурированных белках. Для повышения точности большинство расположенных на поверхности карбоксильных групп было превращено в амиды, чтобы уменьшать число ионизирующихся групп. [c.186]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология