Денатурирование белков

При выделении фермента используют метод фракционирования белков путем изменения pH. Очистка фермента на этой стадии достигается за счет денатурации белков, которые отделяют центрифугированием. Изменение pH белкового раствора следует осуществлять осторожно, по возможности не использовать сильные кислоты и щелочи. Рекомендуется добавлять уксусную кислоту, трис-буфер, карбонат натрия и др. Добавление соответствующего буфера или кислоты проводят на холоде. Их вносят по каплям, по стенке сосуда, при постоянном перемешивании. После нейтрализации раствора проводят короткую инкубацию при 25—30° С, чтобы перед центрифугированием произошла полная агрегация денатурированных белков. [c.199]

В этом разделе были высказаны общие соображения и приведены примеры, относящиеся к очистке и фракционированию нативных белков. Полная денатурация белков производится при оценке их молекулярной массы методом гель-фильтрации. Особенности хроматографии денатурированных белков рассмотрены ниже, в соответствующем разделе. [c.141]

Принято считать, что процесс денатурации сопровождается раскручиванием полипептидных цепей, изменением структуры, характерной для природного белка. В коагуляте денатурированного гемоглобина или денатурированного овальбумина раскрученные полипептидные цепи различных молекул данного белка настолько переплетены между собой, что их уже нельзя разделить, чем и объясняется нерастворимость денатурированного белка. Некоторые химические реагенты, к числу которых относятся сильные кислоты, сильные щелочи и спирты, служат сильными денатурирующими средствами. [c.394]

Время, часы Доля денатурированного белка, % [c.11]

Эластические свойства кератина волос и шерсти, ио данным ронтге-ноструктурного анализа, зависят от того, что в нерастянутом белке полипептидная цепь закручена сама на себя. Растягивание развертывает петли и образуег цепь из аминокислотных единиц с периодом идентичности 3,3 А, сравнимым с таковым для фиброина. Кератин богат цистином, который образует дисульфидные поперечные связи между пептидными цепями. Шерсть может быть модифицирована, а волосы завиты путем восстановления меркаптаном для расщепления части поперечных связей и обратного окисления для образования других поперечных связей. Восстановление, которое в случае завивки производится смачиванием раствором тиогликолевой кислоты, приводит к денатурированному белку с менее жесткой структурой, допускающей растяжение и перестройку молекулы. Появление и исчезновение сульф-гидрильных групп можно проследить при помощи нитропрусоидной пробы. [c.668]

Фракционирование сульфатом аммония. К раствору, в котором на предыдущей стадии образуется осадок денатурированных белков, добавляют сухой мелко измельченный сульфат аммония до насыщения [c.229]

Денатурированные белки обычно менее растворимы, чем нативные формы, их физиологическая активность при денатурации теряется. Вероятно, теряется и способность существовать в кристаллическом состоянии, так как ни один денатурированный белок не был выделен в кристаллической форме. Во многих случаях эти изменения сопровождаются увеличением количества сульфгидрильных групп, как, например, это наблюдается при восстановлении кератина. Молекулярный вес IB большинстве случаев, но не всегда, остается неизменным Так, гемоцианин улитки Helix pomatia) в изоэлектрической точке имеет молекулярный вес 6 740 000, но с из менением. pH распадается на фрагменты, составляющие половину, четверть восьмую части исходной молекулы. Такой же эффект наблюдается и при обработке мочевиной. Например, гемоглобин расщепляется на две равные идентичные части, эдестин — на четыре. Имеются указания на то, что количество кислотных или основных групп уменьшается при денатурации, вероятно, вследствие внутримолекулярных реакций. [c.688]

После центрифугирования смесь разделяется на 4 слоя небольшой осадок, водный слой, плотный слой денатурированного белка и небольшой слой избытка нерастворившегося бутанола. Водный слой с помощью шприца переносят в мерный цилиндр, измеряют объем и переносят в химический стакан (под ток азота) pH раствора доводят деаэрированной 2 н. уксусной кислотой до 6,0. При отделении вод- [c.416]

Из этого списка ясно, чего необходимо избегать, поскольку целесообразнее, конечно, изучать белки в нативном состоянии, а не их денатурированные компоненты. К счастью, глобулярные белки кристаллизуются в нативном состоянии (что, правда, сопряжено со значительными трудностями), в то время как денатурированные белки не обладают кристаллической структурой. Ведь почти все, что нам известно о вторичной и третичной структуре белков, было установлено при помощи рентгеноструктурного анализа отдельных белковых кристаллов. [c.412]

Несмотря на эти ограничения, хироптические методы получили большое значение при конформационном анализе белков. Результативным является прямое сравнение данных, полученных на нативных и денатурированных белках, а также распространение исследований на химически модифицированные белки. [c.385]

Приведем примеры. Гидрофобным взаимодействиям между липидами и белками благоприятствует денатурирование белков. Так, эмульсии, приготовленные с денатурированными глобулинами сои, более стабильны, чем эмульсии с такими же, но нативными белками. [c.317]

По наблюдениям [62] только кипящая вода способна экстрагировать хлорогеновую кислоту. Посредством трех последовательных приемов экстрагирования кипящей водой в количестве, в 25 раз превышающем массу муки, и при кратковременном воздействии (10 с) с целью минимального денатурирования белков [c.404]

Полученный изолят должен иметь все желаемые гарантии качества с санитарной точки зрения (отсутствие патогенной флоры, микробного или иного токсина). В отношении токсичности, обусловленной ботаническим происхождением сырья (например, госсипол хлопчатника), важно приспособить технологию так, чтобы устранить эту токсичность в ходе процесса обработки. Необходимо проявлять особую бдительность в отношении токсинов, появляющихся в результате микробиологических изменений при неправильном хранении семян. В случае афлатоксинов, например арахисового или хлопкового шротов, нет недорогих промышленных технологий, позволяющих удалить их без денатурирования белков. Некоторые способы обработки растворителями, более или менее полярными, могут ограничить их содержание в шротах при извлечении липидов [56]. В большинстве случаев, однако, понадобится подбор сырья, гарантированного от значительного содержания токсинов, чтобы выработанные из него продукты не были ядовиты. [c.452]

Процессы гидролиза денатурированных белков сои и предлагаемые виды использования [c.606]

Биологическая активность белков нередко тесно связана с высокой организацией структуры, и живые организмы синтезируют белки требуемой конформации, которая часто оказывается метастабильной (т. е. из всех возможных структур не самой устойчивой). Под влиянием нагревания, крайних значений pH или многих химических реагентов белки часто теряют свою биологически необходимую конформацию, превращаясь в случайные неорганизованные структурные единицы и утрачивая биологическую активность. Такой процесс называется денатурацией. Наиболее известный пример — изменение структуры яичного белка при нагревании и структуры мяса в процессе приготовления. В последнем случае кулинарная обработка приводит к значительному облегчению процесса переваривания мяса, поскольку при денатурации освобождаются белковые связи, которые в сыром мясе труднодоступны для протеолити-ческих ферментов пищеварительного тракта. При такой денатурации в результате развертывания белковых цепей обнажаются гидрофобные группы, в обычном состоянии направленные внутрь центральной части белковой молекулы. Взаимодействие освобожденных гидрофобных участков рядом расположенных молекул вызывает коагуляцию денатурированного белка. [c.303]

Обе эти формы легко различимы по характерным значениям оптического вращения. Как и в случае нативных и денатурированных белков, беспорядочно ориентированные синтетические полипептиды имеют очень малое вращение, и то время как спирализованные полипептиды обладают большой вращательной способностью. Различие между спиральной конформацией и клубком особенно заметно при рассмотрении кривых дисперсии оптического вращения в далекой ультрафиолетовой области. Блу (1961) сообщил о вращении, измеряемом десятками тысяч градусов. Для этой цели был успешно применен новый прибор для определения спектров кругового дихроизма (Руссель — Улаф, 1961). [c.712]

На рис. 61 представлены графики селективности сефакрилов для двух вариантов фракционирования белков нативных (глобулярных) и денатурированных, имеющих форму статистических клубков (в 6 М растворе гуанидинхлорида). Как и в случае сефадексов, линейные участки графиков лежат в более узком интервале молекулярных масс, чем вся область фракционирования. Кроме того, весьма существенно отличаются друг от друга графики для нативных и денатурированных белков. Например, легко видеть, что нативный белок с М = 100 ОООна сефакриле S-400 должен иметь K v = 0,75, а в денатурированном виде на том же S-400 он будет двигаться в соответствии с Kav = 0,42, т. е. значительно быстрее. Этого и следовало ожидать из-за различия в плотности упаковки нативных и денатурированных белков. [c.118]

Белев и соавторы для определения молекулярных масс денатурированных белков методом гель-фильтрацип использовали сефакрил S-200 Superfine . Колонку размером 1,6 х ЮО см калибровали четырьмя полипептидами с известным числом аминокислотных остатков N) — от 71 (токсин) до 579 (БСА). Элюцию вели 6 М водным раствором гуанидинхлорида (pH 5) со скоростью 3 мл/см -ч. Для точности объем элюента определяли по весу. График селектив- [c.153]

Ферментативные методы гидролиза особенно ценны благодаря присущей им во многих случаях специфичности. Трипсин, представляющий собой так называемую эндопептидазу, быстро расщепляет пептидные связи лишь в том случае, если карбонильная группа расщепляемой амидной связи принадлежит одной из основных аминокислот — лизину или аргинину. Таким образом, трипсин превращает белок в сравнительно малое число триптических пептидов, которые можно разделить и охарактеризовать. Трипсин расщепляет только денатурированные белки, причем для получения хороших результатов нужно предварительно разорвать дисульфидные мостики. [c.166]

В том же году Уи провел фракционирование набора из 16 денатурированных белков на колонке TSK-GEL 3000 SW (фирмы Тоуо Soda ) размером 0,75 X 60 см. В качестве элюеита был использован, как обычно, 6 М раствор гуанидинхлорида в 0,01 М фосфатном буфере, pH 6,5. Скорость элюции была снижена до 66 мл/см -ч, и фракционирование длилось 50 мин. Как видно пз рис. 79, точки калибровочного графика хорошо ложатся на прямую [c.155]

K(i (выше отмечалось, что стоксов радиус для денатурированных белков иропорциоыалоп A/ " ). Об эффективности разрешения белковых фракций по сравнепию с гель-фильтрацией при низком давлеиии в работе сведений не приводится [Ui, 1979]. [c.156]

Мышечный гомогенат центрифугируют 10 мин в центрифуге с охлаждением при 12 000 g. Для инактивации глюкозофосфатизомера-зы проводят тепловую обработку. Мутный экстракт из центрифужных пробирок сливают в стеклянный стакан, доводят его pH до 5,0, добавляя по каплям 1 н. СНзСООН при постоянном перемешивании стеклянной палочкой. Проводят тепловую обработку стакан с экстрактом помещают в водяную баню, нагретую до 85—90°С, и нагревают экстракт, поддерживая указанную температуру в бане, до тех пор, пока его температура достигнет 65° (экстракт постоянно перемешивают). По окончании тепловой обработки стакан с экстрактом помещают в ледяную баню и охлаждают его до 4°С. Осадок денатурированных белков отделяют центрифугированием или фильтрованием. Центрифугат (фильтрат) хранят в рефрижераторе и используют его как источник фосфоглюкомутазы. Так как ферментативная активность сохраняется в течение нескольких недель, экстракт можно использовать при проведении повторных экспериментов. [c.60]

Препараты иммобилизованной глицеральдегид-З-фосфатдегидроге-назы промывают 10-кратным объемом 0,15 М Na l. Добавляют к осажденному центрифугированием гелю равный объем раствора АТФ и инкубируют суспензию при 4° С в течение 2 ч. После окончания инкубации препараты промывают 0,1 М Na-фосфатом для отделения денатурированного белка и АТФ до полного исчезновения поглощения элюата при 260 и 280 нм. В полученных препаратах иммобилизованных димеров определяют активность и содержание белка. Такого рода определения можно проводить и в процессе инкубации с АТФ для выяснения особенностей протекания процесса диссоциации иммобилизованного тетрамера. [c.301]

К насыщенному раствору (NH4)2S04 добавляют 2 н. NaOH и доводят pH до 7,8. При постоянном перемешивании медленно, по каплям к 50 мл сыворотки кролика добавляют 80 мл насыщенного раствора сульфата аммония (pH 7,8) и перемешивают в течение 2—3 ч. Центрифугируют суспензию при комнатной температуре 30 мин при 1500 g. Первый осадок содержит все -у-глобулины, другие глобулины и следы альбумина. Растворяют осадок в дистиллированной воде до начального объема сыворотки (50 мл). Очищают фракцию у-глобули-нов вторым и третьим осаждениями. После третьего осаждения растворяют осадок в боратном буфере (pH 8,45) до конечного объема 20— 25 мл. Удаляют сульфат аммония диализом при 4°С против боратного буфера в течение 2—3 дней со сменой буфера утром и вечером. Полученный после диализа препарат иммуноглобулинов обычно содержит небольшой осадок денатурированного белка и слегка опалесцирует. Центрифугируют при 4° С в течение 30 мин при 1400 s. В полученном препарате проверяют содержание белка и титров антител. Определяют белковый состав методом электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии ДСН (с. 119). Если полученный препарат у-глобулинов не отвечает требованиям эксперимента по стоте, проводят дальнейшую очистку с применением ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе. [c.308]

Асцитные жидкости центрифугируют при 50 ООО в течение 30 мин. Супернатант разбавляют в четыре раза холодным фосфатным буфером. Добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония при постоянном перемешивании и оставляют на 1 ч при 4°С. Центрифугируют при 5000 g в течение 10 мин. Осадок растворяют в буфере В и диализуют против буфера Б. Меняют буфер через 3—4 ч. Диализуют не менее 8 ч. Центрифугируют при 15000 g в течение 10 мин для удаления денатурированных белков. Измеряют экстинкцию при 280 нм предварительно разбавленного в 100 раз раствора и по формуле ( 280 1,25) рассчитывают содержание белка в миллиграммах (асцитн ле жидкости содержат обычно 25—35 мг/мл белка). [c.316]

Контрольная проба не содержит глюкозо-6-фосфат. Реакцию начинают добавлением ферментного препарата при 30 °С. После 10-ми-нутноч инкубации реакцию останавливают добавлением 1 мл 10%-ной трихлоруксусной кислоты. Пробы охлаждают до О °С, выпавший осадок денатурированного белка отделяют центрифугированием при 2000 об/мин 3 течение 10 мин. В полученных супернатантах pH доводят до 7,0 (конечный объем пробы 3 мл) и определяют содержание Фн методом Фиске—Суббароу или Самнера, используя аликвоты супернатанта объемом 0,5—1 мл (с. 34, 35). [c.372]

Условия инкубации те же, что и в случае определения гидролазной активности. Реакцию останавливают нагреванием проб в кипящей водяной бане. Осадок денатурированного белка отделяют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 10 мин. [c.372]

Хотя ни один из хиральных атомов не претерпел рацемизации , кривая дисперсип оптического вращения глобулярного белка в нативном состоянии будет отличаться от кривой дисперсии оптического вращения соответствующего денатурированного белка . Объясните это высказывание с точки зрения первичной и вторичной структуры белков. (Обратите внимание на то, что слово рацемизация приведено в кавычках. При изменении конфигурации хирального атома в молекуле, содержащей несколько хиральных атомов, образуется не энантиомер исходного продукта, а диастереомер.) [c.417]

Этот технологический процесс, разработанный Венджером и др. [96] под названием Юни-текс , предполагает использова-ние двух последовательных термоэкструдеров. В первом экстру-I дере смесь сырья увлажняется, подогревается и превращается в однородную пластифицированную массу с денатурированными белками. На этой стадии нет еще никакой ориентации элементов структуры. Из аппарата масса поступает непрерывно и без промежуточных звеньев во второй экструдер. Прохождение ее при атмосферном давлении позволяет удалять летучие соединения, нередко обусловливающие нежелательные привкусы. Вторая экструзия под давлением меньше 1 МПа имеет целью ориентировать и фиксировать элементы структуры. Продукт, получаемый на выходе из фильеры, содержит около 30 % воды, что требует его дополнительной сушки. Высушенный продукт при влажности 7 % имеет повышенную плотность — 0,4—0,6 г/см . После повторной [c.555]

Рис. 11.11. Схематическое изображение механизмов текстурирования путем замораживания. Денатурированные белки в жидком (а), замороженном (б) и сухом (а) состоянии. При замораживании между белками появляются кристаллики льда, при высушивании — вакуоли с воздухом (по Фукушиме 38 ).

Ферментативный гидролиз нативных белков, как правило, протекает менее полно, чем гидролиз денатурированных белков и белков с разделенными цепями в аналогичных условиях [128]. Во многих случаях в результате такого более специфического расщепления пблучаются более крупные обломки исходной молекулы. Ранее отмечалось, что после окисления ри бонуклеаза в большей степени подвержена ферментативному гидролизу. [c.178]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология