Изотахофорез препаративный

Как препаративный метод изотахофорез обладает совершенно исключительной особенностью, а именно разрешающая способность метода не уменьшается с увеличением количества об- [c.317]

Рис. 12.14. Схема прибора для препаративного гель-изотахофореза с постоянным элюированием [17].

ПРЕПАРАТИВНЫЙ ИЗОТАХОФОРЕЗ ГЕМОГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА [93] [c.348]

Основные исходные растворы для препаративного изотахофореза в полиакриламидном геле [93] [c.350]

Разделять смеси белков посредством электрофореза начали еще в первые годы XX в. Однако до сравнительно недавнего времени этот метод применялся лишь в аналитических целях. В течение 30 и более лет широко использовался довольно Сложный аппарат Тизелиуса для электрофореза в свободном растворе, однако с его помощью не всегда удавалось добиться полного разделения компонентов. И до сих пор остается справедливым утверждение, что электрофорез — это в основном аналитический метод. Все современные более тонкие электрофоретические методы, такие, как гель-электрофорез, изоэлектрическое фокусирование и изотахофорез, были разработаны главным образом с целью улучшить способы анализа смесей белков. Тем не менее каждый из этих методов может быть приспособлен для препаративных целей с использованием десятков и даже сотен миллиграммов белковой смеси. [c.213]

После нанесения образца включают ток ионы с самой высокой подвижностью движутся к соответствующему электроду первыми. На некотором расстоянии от них следуют самые малоподвижные ионы, а ионы образца, обладающие промежуточной подвижностью, располагаются между ними соответственно их относительным подвижностям. Если подвижности ионов образца очень близки, разрешение можно улучшить путем внесения в исходный образец синтетических амфолитов, называемых ионами-прокладками. Эти ионы по сравнению с ионами образца обладают промежуточной подвижностью и, располагаясь между ними, способствуют разделению последних. Ионы-прокладки сходны с теми, которые применяются при электрофокусировании. Они создают градиент pH между ведущими и замыкающими ионами, способствуя тем самым дополнительному разделению ионов образца по принципу электрофокусирования. Изотахофорез обладает очень высокой разрешающей способностью и применяется как для аналитического, так и для препаративного разделения самых разнообразных веществ. [c.136]

Электрофокусирование и изотахофорез, обладая хорошим разрешением, применяются при аналитических исследованиях, но, подобно непрерывному электрофорезу, особенно широко используются для препаративных целей. Этими методами можно разделять относительно большие количества материала, который в конце разделения может быть получен обратно. С их помощью успешно проводили вьщеление пептидов, белков, нуклеотидов и т. д. [c.137]

При изотахофорезе (iso — равный, ta ho — скорость) [47, 48], также обладающем высокой разрешающей способностью, разделяемую белковую смесь вводят в специальный электролит, содержащий ионы с более высокой подвижностью (лидирующие) и ионы с меньшей подвижностью (терминирующие), чем подвижность ионов белка при равных скоростях перемещения. При добавлении специфических промежуточных ионов, поддерживающих интервал , разделяются белки с очень близкими подвижностями. Препаративное разделение белков проводят большей частью в колонках с полиакриламидным гелем при применении амфолитов в качестве буферных и поддерживающих интервал веществ, причем разделенные компонент- элюируются из колонки с помощью подходящей системы. [c.351]

Четвертым основным методом разделения, который быстро развивается в настоящее время, является изотахофорез (ИТФ). В отличие от других методов ИТФ требует использования двух электролитов, а именно ведущего (leading) электролита, который содержит ион с максимальной электрофоретической подвижностью, и замыкающего (terminating) электролита, который содержит ион с минимальной подвижностью по сравнению с промежуточной подвижностью ионов, входящих в состав анализируемой смеси. Исходное расположение ведущий ион — (A+B + + D)—замыкающий ион постепенно изменяется до состояния, аналогичного получаемому по методу с подвижной границей. Когда ионы исследуемой смеси достигают состояния ведущий ион — А, В, С, D — замыкающий ион , разделение зон прекращается, так как электролит-носитель отсутствует. Перемещение зарядов осуществляется только в результате перемещения компонентов исследуемой смеси и любых ионов противО положного заряда. Установлено, что все компоненты движутся с одинаковой скоростью. Дискретное распределение электрического поля в зонах приводит к резко выраженным границам раздела зон. Возможность регулирования концентраций в ис- Следуемых зонах путем изменения свойств ведущего электролита и равномерность концентрации данного компонента внутри каждой изучаемой зоны делают этот метод особенно ценным для качественного и количественного анализа, а также для препаративного разделения. Практические возможности применения основных электромиграционных методов приведены в табл. 12.2. [c.281]

Полиакриламидный гель наименее химически активен. Его> слабое сродство к красителям позволяет осуществлять быстрое обнаружение биополимеров, главным образом белков, нуклеиновых кислот и продуктов их деградации, с помощью окрашивания. Прозрачный полиакриламидный гель обладает хорошими механическими свойствами, допускающими изменение концентрации полиакриламида в самых широких пределах. Электроос-мотические эффекты в этом геле очень малы. Условия аналитических и препаративных разделений на полиакриламидном геле путем зонного электрофореза в гомогенных и дискретных системах буферных растворов [48, 77], а также изотахофореза и изо-электрического фракционирования хорошо изучены. [c.299]

Рис. 12.31. Препаративный изотахофорез компонентов гемоглобина человека в> полиакриламидном геле (по данным Свендсена [93]).

Концентрирующий гель можно с успехом использовать в препаративной колонке (для которой иногда требуются большие количества геля), чтобы устранить нежелательные эффекты, вызванные наличием солей и отсутствием преэлектрофоре-за [1184]. Концентрация этого геля должна быть такой, чтобы белки до. вхождения в разделяющий гель подверглись предварительному фракционированию в соответствии с размерами их молекул. Подобным способом можно предотвратить закупоривание разделяющего геля концентрированным раствором белков. Если же исследуемая проба очень разбавлена, то рекомендуется применить более разведенный концентрирующий гель,, не обладающий свойствами молекулярного сита. Это даст возможность сконцентрировать белковые компоненты ири помощи изотахофореза. Таиим образом, концентрирующий гель играет довольно существенную роль при препаративном электрофорезе в полиакриламидном геле. [c.115]

Система 3 [280]. Применяется для препаративного изотахофореза. 100 мл раствора акриламида [3,67% Т, 5% С, 0,012 М. трис —0,01 ЗМ какодилат (pH 7), 0,25 мг% рибофлавина, Ю мкл ТЕМЭД на 100 мл смеси] полимеризуют в стеклянной колонке длиной 30 ом (составная часть прибора Унифор фирмы ЬКВ-Рго(1ис1ег АВ). Полимеризация заканчивается после 3 ч облучения. Нижний электродный сосущ, и резервуар для буфера заполняют ведущим электролитом (0,012 М трис —0,013> М какодилат, pH 7), а замыкающий буфер (0,032 М трис — 0,188 М р-аланин, pH 8,95) наливают поверх геля и в верхний резервуар для буфера. Затем через капилляр, расположенный в верхней части прибора, на поверхность геля наносят слой амфолина (40%, ИЭТ 5—7) объемом 2 мл. Устанавливают постоянный электрический ток (10 мА), причем катод должен быть в верх1Н ем электродном сосуде. Через 5 ч после того, как весь амфолин войдет в гель, ток отключают и на поверхность геля через капилляр наносят пробу, состоящую из 2 мл сыворотки, смешанной с 2 мл замыкающего буфера. Затем вновь включают ток (10 мА) и начинают элюцию ведущим буфером. [c.177]

Проводимости белковых молекул настолько низки, что устойчивая граница может существовать лишь при чрезвычайно высоких потенциалах, представляющих к тому же опасность для персонала лаборатории. Чтобы избежать этого, препаративный изотахофорез белков проводят в присутствии амфолитов, которые ипрают роль прокладок (spa ers), имеющих промежуточную по сравнению с белковыми компонентами подвижность. Эти прокладки увеличивают проводимость и способствуют образованию более устойчивых границ между компонентами. Их присутствие облегчает также создание градиента pH. Таким об разом, изотахофорез белков сходен с изоэлектрическим фокусированием, за исключением того, что компоненты в случае изотахофореза продолжают перемещаться (и со временем выходят из колонки), причем индивидуальные компоненты никогда не достигают области, где значения ipH соответствуют их изоэлектрическим точкам. Этам способом удается преодолеть три недостатка изоэлектрического фокусирования. Белок способен выходить из канала разделения и может быть собран так же, как и при простом электрофорезе. Неустойчивость белков в их изоэлекпрических точках перестает быть проблемой, если сохраняется более высокое значение pH (или более низкое при изменении общего направления потока). Не нужно также опасаться не растворимости белка в изоэлектрической точке. Основной недостаток этого метода по сравнению с изоэлектрическим фокусированием заключается в том, что он обладает [c.234]

Из-за сложности аппарату1ры и относительно меньшей известности этого метода он используется довольно редко, и в литературе описано очень мало действительно успешных случаев применения препаративного изотахофореза. Однако этот метод обладает многообещающими достоинствами и в будущем, несомненно, получит более ши рокое распространение. [c.235]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология