Белки изотахофорез

Изотахофорез. При разделении белков этим методом зоны распределяются в соответствии с их подвижностью и мигрируют с одинаковой скоростью. [c.216]

ИЗУЧЕНИЕ БЕЛКОВ МЕТОДОМ ИЗОТАХОФОРЕЗА [c.173]

Преимущества и недостатки неоднородных буферных систем. Основное преимущество диск-электрофореза заключает- ся в концентрировании разделяемых веществ с образованием очень узких зон. Недостатком является то, что в процессе изотахофореза белки могут достигать такой высокой концентрации, что это вызывает их осаждение. Кроме того, некоторые белки нестабильны в зоне pH, используемой для их исследования методом диск-электрофореза. [c.88]

На стадии расфокусирования зоны переходят из концентрирующего геля в разделяющий. В разделяющем геле компоненты подвергаются просеиванию , и, следовательно, их подвижность уменьшается из-за более высокой концентрации акриламида. Это резко нарушает стационарные условия, которые определяют существование стопки зон при изотахофорезе. Разделяющий гель готовят в разделяющем буферном растворе (фаза гамма), который содержит компонент 3 и противоион 6, pH разделяющего геля должен отличаться от pH фазы бета (при миграции к аноду быть более высоким). По мере того как фаза бета мигрирует в разделяющий гель, создается новая фаза — ламбда. По мере перемещения движущейся границы (ламбда/гамма) компонент 1 фазы дзета вступает в разделяющий гель, его подвижность становится больше подвижности белков, и компонент 1 начинает двигаться впереди них. Таким образом, появляется новая фаза пи и новая движущаяся граница (пи/ламбда), через которую проходят все зоны белков. Они разделяются в соответствии с их индивидуальными скоростями, определяемыми величиной pH фазы пи, проводимостью и величиной приложенного напряжения. Высокому разрешению при таком разделении белков способствуют несколько факторов а) узкая стартовая зо- [c.122]

Для того чтобы предотвратить диффузию компонентов пробы вверх и тепловую конвекцию, было предложено [912] помещать над пробой еще один слой геля. Рекомендуется исследуемые вещества растворять в том же буфере, на котором приготовлен концентрирующий гель. Если образец сильно разведен, то для концентрирования белков путем изотахофореза [281] или методом скачка напряжения [570] требуется более толстый слой концентрирующего геля. В случае высокого исходного содержания солей в анализируемом препарате следует либо удалить их с помощью диализа, гель-фильтрации или каким-то другим способом, либо, если позволяет концентрация макромолекул, развести пробу. Для получения воспроизводимых результатов необходимо, чтобы во всех опытах наносимый раствор имел совершенно одинаковые ионную силу, pH и объем. [c.98]

Основываясь на этих принципах, можно вывести несколько уравнений, позволяющих рассчитать системы для изотахофореза катионов [99], анионов [348] и белков [233, 646, 1116]. Более детальное описание метода читатель найдет в ряде прекрасных обзоров [347, 352, 353, 906, 1116]. [c.168]

Для разделения с помощью изотахофореза двух ионов необходимо, чтобы их подвижности различались по крайней мере на 10% [99]. Подвижность иона зависит от нескольких параметров, например сольватации, вязкости растворителя, диэлектрической постоянной, наконец, радиуса и заряда иона [99]. Ее можно изменять, варьируя растворители или pH, определяющий соотношение между диссоциированными и недиссоцииро-ван ыми молекулами. Так, ионы К+ и NH+4 имеют в воде почти одинаковую подвижность, между тем они очень хорошо разделяются в метаноле [98]. Подвижность белков сильно зависит от pH, поэтому pH играет решающую роль при изотахофорезе белков. Все зоны имеют разные величины pH. В анионной системе величина pH обычно возрастает в направлении от ведущего иона к замыкающему. При экстремальных значениях pH (ниже pH 3 и выше pH 10) условия изотахофореза нарушаются, так как ионы Н+ и 0Н сами обеспечивают проводимость. Присутствие карбоната при высоких pH также оказывает неблагоприятное действие [501, 1116]. Если в анионной системе величина pH более чем на 1 единицу ниже (а в катионной системе выше), чем величины р/С соответствующих видов ионов, то эффективная подвижность окажется настолько низкой, что возникает потребность в очень высоком градиенте напряжения,. который невозможно обеспечить доступными источниками питания. Степень варьирования pH ограничена также буферной емкостью противоиона [99]. [c.170]

Подвиж ность белков в свободном растворе примерно на порядок ниже, чем подвижность небольших молекул. Например, для белков сыворотки крови при pH 8,6 и 25 °С она составляет 1,2-10-5—7,б-10 5 см2/(В-с) [1116]. Поэтому изотахофорез макромолекул можно. проводить в более коротких трубках, но вместе с тем при этом необходимо попользовать какую-либо ан-ти конвекционную среду (обычно крупнопористый полиакриламидный гель). В процессе изотахофореза белки могут достигать очень высоких концентраций, часто 5—10%. Это означает, что они собираются в очень узкие зоны, тесно прилегающие одна к другой, и поэтому их не удается различить дау е с по- [c.173]

В ряде работ [233, 478, Ц79, 1116] были подробно изучены параметры изотахофореза белков и показано, что амфолиты-носители способны выполнять роль пространственных разобщителей (спей-серов). Отрицательная сторно-на их применения заключается в том, что часть молекул амфолитов-носителей может обладать такими же подвижностями, как и отдельные исследуемые белки, что приведет к расшире- [c.174]

Изотахофорез был с успехом применен для получения гемоглобина человека [1256], продуктов распада фибриногена "238], а также при изучении белков сыворотки крови (рис. 68) 207, 233, 408, 1116] и спинномозговой жидкости человека 683]. [c.175]

СИСТЕМЫ ДЛЯ РАЗДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ МЕТОДОМ ИЗОТАХОФОРЕЗА [c.177]

Электрофорез в полиакриламидном геле с ДСН можно проводить как в однородных, так и неоднородных буферных системах [325, 756, 1171, 1379], в которых концентрирование белков происходит в результате изотахофореза [732, 922]. [c.225]

Обесцвечивание фона можно проводить путем четырехкратного промывания гелей 0,05%-ной уксусной кислотой. Другие авторы 478] применяли для окрашивания белков после изотахофореза раствор, содержащий 50 мг хлористой ртути и 0,5 г бромфенолового синего в 500 мл 50%-ного водного этанола. Для обесцвечивания гели вымачивали в 30%-ном этаноле и 5%-ной уксусной кислоте [478]. [c.271]

Коллективная монография, написанная ведущими специалистами, работавшими в Базельском институте иммунологии (Швейцария), посвящена методам иммунохимии и клеточной иммунологии. Авторы имеют большой опыт в этой области, что определяет основные достоинства книги — удачный подбор методов и исчерпывающее, но вместе с тем краткое описание каждого из них. Рассмотрены определение активности антител, их анализ методом пептидных карт, исследование белков методами электрофореза, изоэлектрофокусирования и изотахофореза, методы иммунофлуоресценции, культивирования лимфоцитов, изотопные и другие методы. [c.4]

Постепенно они выстраиваются в порядке убывания их электрофоретических подвижностей. Замыкает цепочку ион верхнего резервуара. В установившемся режиме вся эта цепь ионов движется вдоль геля с постоянной скоростью (отсюда и название— изотахофорез ). Напряженность электрического поля ступенчато увеличивается при переходе от зоны одного иона к зоне следующего за ним другого пропорционально последовательному уменьшению электрофоретических подвижностей этих ионов. Это вытекает из условия равенства скоростей миграции всех ионов, поскольку скорость миграции определяется произведением электрофоретической подвижности иона на напряженность поля. Требование же равенства скоростей вытекает из очевидного условия непрерывности и постоянства электрического тока вдоль всего геля. Распределение напряженности по зонам миграции каждого из белковых ионов диктуется соотношением электрических сопротивлений этих зон, которые зависят от концентрации в них ионов. Эти концентрации устанавливаются под действием самого поля, за счет сужения или расширения каждой зоны в зависимости от того, в каком количестве соответствующий белковый ион представлен в исходной смеси белков. В процессе миграции вдоль геля эти зоны сохраняют неизменную ширину. [c.76]

Когда писались эти строчки, трудно было предположить, что до такой демонстрации остается меньше времени, чем необходимо для подготовки рукописи к печати. Однако перед самой отправкой ее в типографию была опубликована исключительно красивая работа Г. И. Абелева и Э. Р. Каримовой, коренным образом меняющая ситуацию с изотахофорезом белков. Излагаем вкратце ее идею и даем ссылку на первоисточник [Абелев, Каримова, 1982]. [c.78]

Разделять смеси белков посредством электрофореза начали еще в первые годы XX в. Однако до сравнительно недавнего времени этот метод применялся лишь в аналитических целях. В течение 30 и более лет широко использовался довольно Сложный аппарат Тизелиуса для электрофореза в свободном растворе, однако с его помощью не всегда удавалось добиться полного разделения компонентов. И до сих пор остается справедливым утверждение, что электрофорез — это в основном аналитический метод. Все современные более тонкие электрофоретические методы, такие, как гель-электрофорез, изоэлектрическое фокусирование и изотахофорез, были разработаны главным образом с целью улучшить способы анализа смесей белков. Тем не менее каждый из этих методов может быть приспособлен для препаративных целей с использованием десятков и даже сотен миллиграммов белковой смеси. [c.213]

Высокая степень разрешения этого метода обусловлена одним важным преимуществом его по сравнению с другими разновидностями электрофореза. Это преимущество отражено в термине фокусирование . В других методах разделения белков (за исключением изотахофореза — см. ниже) диффузия и перемешивание зон белка возрастают во времени. При изоэлектрическом фокусировании диффузия ограниченна, потому что, как только белковая молекула диффундирует и попадает в зону, отличающуюся по значению pH от ее изоэлектрической точки, она становится заряженной и мигрирует в обратном направлении. По завершении фокусирования теоретически ни один компонент системы не должен двигаться, и потому ток не может проходить (других ионов в системе нет). Следовательно, наложение сильных электрических полей должно приводить лишь к незначительному нагреванию, причем фокусирование будет осуществляться очень быстро. На самом деле слабый ток все же идет, и, если использованное напряжение слишком велико, градиент может исказиться и стать менее четко выраженным. [c.226]

Изотахофорез — метод разделения белков на ряд последовательных зон в соответствии с их электрофоретической подвижностью [58, 61, 62, 65]. Под действием постоянного тока зоны белков располагаются непосредственно друг за другом, как бы складываются в стопку . В присутствии противоионов такие стопки из зон белка, имеющих различные значения pH, образуются между ведущими и замыкающими ионами. Скорость, с которой перемещаются зоны белка, и распределение концентраций ионов между их границами определяются концентрацией ведущих ионов. Объясняется это следующим скорость, с которой мигрирует замыкающий ион, зависит от скорости миграции ведущего иона, т. е. ион с самой малой собственной подвижностью перемещается с такой же скоростью, как и ион с самой высокой подвижностью, вследствие увеличения градиента напряжения в направлении, обратном направлению миграции. Внутри стопки белки концентрируются в узких зо нах, так как концентрация ионов на каждой стороне движущейся границы фиксирована согласно принципу Кольрауша [65]. Разделение зон белка достигается при помощи разделителей ( спейсеров ), т. е. веществ, ионы которых обладают промежу- [c.120]

При изотахофорезе (iso — равный, ta ho — скорость) [47, 48], также обладающем высокой разрешающей способностью, разделяемую белковую смесь вводят в специальный электролит, содержащий ионы с более высокой подвижностью (лидирующие) и ионы с меньшей подвижностью (терминирующие), чем подвижность ионов белка при равных скоростях перемещения. При добавлении специфических промежуточных ионов, поддерживающих интервал , разделяются белки с очень близкими подвижностями. Препаративное разделение белков проводят большей частью в колонках с полиакриламидным гелем при применении амфолитов в качестве буферных и поддерживающих интервал веществ, причем разделенные компонент- элюируются из колонки с помощью подходящей системы. [c.351]

Существует три типа электрофоретических систем электрофорез по Тизелиусу (с подвижной границей) зональный электрофорез (например, в среде с капиллярной структурой) стационарный электрофорез (изоэлектрическое фокусирование, изотахофорез). В медицинской и фармацевтической практике чаще применяется зональный электрофорез на фильтровальной бумаге, пленке из ацетатцел-люлозы, агаровом, агарозном, крахмальном или полиакриламидном гелях. Электрофорез белков сыворотки крови ведут в буферной среде с pH 8,6, когда молекулы белка и липопротеинов заряжаются отрицательно и движутся к аноду. После заверщения электрофоретического разделения электрофореграммы фиксируются и окрашиваются. Затем производят визуальную и денситометрическую оценку разделения белков. Для окраски различных белков на электрофоре-граммах используют специальные красители, часть из которых представлена в табл. 5. [c.44]

Весьма перспективными методами разделения белков (как и определения ряда физико-химических свойств) оказались разные варианты метода изоэлектрического фокусировання-изотахофореза, основанные на проведении электрофореза в поддерживающих средах (на колонке или в тонком слое) с градиентом pH. Точное местоположение на колонке каждого белка из смеси определяется значением его изоэлектрической точки, т.е. состоянием, при котором суммарный электрический заряд белковой частицы при данном значении pH равен нулю. При использовании [c.31]

Из исследований в области электрохроматографии следует отметить опубликованную в 1937 г. работу Тизелиуса (электрофоретическое разделение белков) и метод изотахофореза, предложенный Константиновым и Ошурковой. [c.12]

Полиакриламидный гель наименее химически активен. Его> слабое сродство к красителям позволяет осуществлять быстрое обнаружение биополимеров, главным образом белков, нуклеиновых кислот и продуктов их деградации, с помощью окрашивания. Прозрачный полиакриламидный гель обладает хорошими механическими свойствами, допускающими изменение концентрации полиакриламида в самых широких пределах. Электроос-мотические эффекты в этом геле очень малы. Условия аналитических и препаративных разделений на полиакриламидном геле путем зонного электрофореза в гомогенных и дискретных системах буферных растворов [48, 77], а также изотахофореза и изо-электрического фракционирования хорошо изучены. [c.299]

В ко]щентрирующем и стартовом гелях белки должны концентрироваться в результате изотахофореза [942]. При тех значениях pH, которые имеют эти гели, буферный (замыкающий) ион, находящийся в электродных сосудах, должен иметь наименьшую электрофоретическую подвижность. [c.86]

В качестве примера неоднородной системы приведем здесь-с.хему, описанную Орнштейном [942] и Дэвисом [281]. Поскольку подв ижности сывороточных белков при pH 8,0 лежат в пределах 0,6-10- —8 10- см -В- -с- , желательно, чтобы подвижность замыкающего иона была ниже 0,6-10 см -В - С . Подвижность иона глицината в свободном растворе равна — 15 единицам подвижности (1 единица подвижности соответствует 10 см2-В- -с- ). Чтобы в буфере подвижность этого иона составила —0,6 единицы, степень ионизации глицина не должна превышать /зо- Согласно уравнению Гендерсона — Гассельбаха, такая степень ионизации получается при pH 8,3. Хорошей буферной емкостью при этом pH обладает трис. Ведущим ионом является С1-. В процессе изотахофореза белки концентрируются и входят в разделяющий гель, где скорость их движения замедляется вследствие эффекта молекулярного-сита. С другой стороны, из-за зменения pH при входе в разделяющий гель (pH 9,5) подвижность глицината становится равной 5 единицам, в результате чего этот ион перегоняет вег-сывороточные белки. (Движение глицината не тормозится гелем, поэтому для того, чтобы он достиг более высокой скорости, чем любой компонент белковой смеси, даже и не требуется изменения pH.) [c.87]

КОЙ концентрации, то после наложения электрического поля в зоне нанесенной пробы образуется более высокий градиент напряжения, чем в остальных участках геля, в результате чего-белки начинают двигаться с относительно высокой скоростью, У поверхности разделяющего геля движение белков замедляется, потому что, во-первых, в разделяющем геле градиент напряжения Падает и, во-вторых, в нем начинает проявляться эффект молекулярного сита. Однако концентрирующий эффект такого метода, безуслов но, не столь велик, как в случае изотахофореза. Кроме того, при низкой ионной силе отдельные белки могут образовьгвать агрегаты. [c.89]

Концентрирующий гель можно с успехом использовать в препаративной колонке (для которой иногда требуются большие количества геля), чтобы устранить нежелательные эффекты, вызванные наличием солей и отсутствием преэлектрофоре-за [1184]. Концентрация этого геля должна быть такой, чтобы белки до. вхождения в разделяющий гель подверглись предварительному фракционированию в соответствии с размерами их молекул. Подобным способом можно предотвратить закупоривание разделяющего геля концентрированным раствором белков. Если же исследуемая проба очень разбавлена, то рекомендуется применить более разведенный концентрирующий гель,, не обладающий свойствами молекулярного сита. Это даст возможность сконцентрировать белковые компоненты ири помощи изотахофореза. Таиим образом, концентрирующий гель играет довольно существенную роль при препаративном электрофорезе в полиакриламидном геле. [c.115]

Для изотахофореза белков желательно испольэовать узкие трубки и проводить его в полиакриламидных гелях, не проявляющих по отношению к исследуемым веществам свойства молекулярного сита. Изотахофорез обладает почти таким же хорошим разрешением, как и диск-электрофорез или изоэлектрическое фокусирование. Изо-тахофореграммы белковых смесей очень похожи на картины изоэлектрофокусирования [1116], так как компоненты таких смесей в кислотной системе разделяются главным образом в результате различий в значениях их ИЭТ [501]. Преимущество же изо тахофореза заключается в том, что в отличие от изо- [c.175]

В этой главе рассматриваются аналитические приемы, получившие широкое применение в химии белка (если они не обсуждаются в других разделах книги). Неискушенному читателю может показаться, что здесь дано слишком много альтернативных методов и в иекоторых случаях вполне достаточно было бы привести один из них. Автор признает возможность такого рода критических замечаний, но подчеркивает, что нет такого метода который оказался бы в одинаковой степени пригодным для всех белков, поскольку, с одной стороны, весьма различны природа исследуемых объектов и их доступность в количественном отношении с другой — лаборатории, занимающиеся изучением белков, резко отличаются друг от друга по оснащенности реактивами, приборами и другими техническими средствами. В целях сокращения объема рассматриваемого здесь материала некоторые из методов, например изотахофорез и хроматофокусирование, ие обсуждаются. [c.243]

Белки эффективно концентрируются с помощью электрофореза в ПААГ [63, 196, 276, 277, 382] или изотахофореза [283J. Применение электрофоретической процедуры для концентрирования макромолекул путем осаждения [308] или извлечения белков из неионных растворов с использованием мембран [3] может осложняться необратимой сорбцией белка иа мембране. С этой проблемой сталкиваются также и при работе с жидкими мембранами [384, 385] (см. дальше). Белки из разбавленного раствора (100—800 нг/мл) были выделены осаждением после введения радиоактивной метки с помощью [ Н]-1-фторо-2,4-ди-иитробензола [280]. Для снятия белков с ДЭАЭ-целлюлозы в высококонцентрированной форме использовался карбоксиметил-декстран [367]. [c.246]

В 34 главах изложены методы определения, выделения и очистки антител (включая дансилироваиие, двумерную хроматографию, изоэлектрофокусирование, электрофорез в полиакриламидном геле и изотахофорез) методы определения констант равновесия (равновесный диализ, равновесная фильтрация и седиментация) способы маркировки реагентов изотопами и флуоресцентными красителями и определение компонентов клеточной поверхности меры предосторожности при работе в изотопной лаборатории методы химической модификации белков, гаптенов и нерастворимых носителей приемы получения аитн-сывороток к аллотипам и антигенам гистосовместимости и получения антител доминирующего клонотипа методы оценки гистосовместимости и реакций в смешанной культуре лимфоцитов методы разделения клеток на гелях, несу- [c.7]

Подобного рода затруднения можно, по крайней мере в изученных нами случаях, преодолеть, используя изотахофорез (ИТФ) — один из методов электрофореза, основанный на принципе регулирующей функции Кольрауша (Kohlraus h, 1897). При ИТФ ионы разделяемого образца располагаются в порядке уменьшающейся электрофоретической подвижности между двумя соответственно подобранными видами ионов, один из которых ( ведущие ионы ) имеет более высокую подвижность, чем другой ( замыкающие ионы ). Так как принцип регулирующей функции действителен как для больших, так и для малых ионов, ИТФ при выполнении некоторых условий позволяет анализировать белки без особых затруднений. Эти условия следующие [c.143]

Этот относительно новый метод фракционирования биологических молекул, в том числе и белков, предложен специалистами фирмы LKB более 10 лет назад. С тех пор фирма не прекращает усилий по пропаганде метода и рекламе разработанного специально для него прибора Тахофор . Однако широкого распространения для фракционирования и исследования белков метод пока не получил. На то есть объективные причины некоторые из них будут названы ниже. В связи с этим мы ограничимся кратким знакомством с принципом и особенностями метода изотахофореза в ожидании его дальнейшего развития. [c.75]

При изотахофорезе белков их концентрация соизмерима с концентрацией быстро мигрирующего иона, вначале заполняющего весь объем геля. Электрофоретическая подвижность замыкающего иона, находящегося первоначально в верхнем электродном резервуаре, остается все время меньше, чем подвижность самого медленного из белков смеси. При включении эле1ктрического тока быстро мигрирующий ион буфера опять отходит к нижнему электроду, но теперь вплотную за ним следуют сами белки, выступающие в роли переносящих ток ионов. [c.75]

Описанная сортировка белков смеси по зонам в соответствии с их электрофоретическими подвижностями практически бесполезна, так как белки двигаются вплотную друг за другом, что не позволяет им надежно разделиться. Однако в исходную белковую смесь можно добавить ионы небелковой природы, которые будут вклиниваться между зонами белков и разделять их друг от друга,— так называемые спейсеры . Они могут быть низкомолекулярными, что позволит далее легко очистить от них белки. Например, при изотахофорезе белков сыворотки крови в нее добавляли следующие аминокислоты аспарагин, глицин и -аланин [8сЬа[ег-Н1е15еп е1 а1., 1980]. Электрофоретические подвижности этих аминокислот не одинаковы, но лежат внутри диапазона подвижностей, характерных для белков сыворотки. При формировании движущейся цепочки зон ионов каждая из аминокислот вклинивается на соответствующее место, раздвинув две соседние белковые зоны. Теперь белки сыворотки разобьются на четыре отделенные друг от друга группы. Число спейсерных добавок можно увеличить, [c.76]

В рассмотренном примере использования аминокислот в качестве спейсеров изотахофорез проводили в 6,4%-ном ПААГ. После окончания фракционирования (формирования четких зон) белки фиксировали и окрашивали в геле красителем СВВ G-250. В приборе Тахофор изотахофорез микроколичеств белковой смеси и амфолинов проводят в жидкости, заполняющей длинный (до 80 см), хорошо термостатированный тефлоновый капилляр диаметром 0,5 мм. Препарат вводят с помощью микрошприца. Благодаря низкой концентрации амфолинов и белков, а также большой длине капилляра рабочие напряжения в приборе достигают десятка тысяч и более вольт. Регистрацию белковых зон на выходе из капилляра осуществляют с помощью денситометра по УФ-поглощению при 280 нм. Зоны белков и амфолинов в этом приборе мигрируют быстро, и весь анализ белковой смеси обычно занимает менее часа. Однако главный недостаток метода остается в силе —заранее е известно, какие белки и в какой степени будут раздвинуты амфолина-ми. Концентрацию последних приходится брать низкой, чтобы не помешать проявлению проводимости за счет белков. Но смесь амфолинов многокомпонентна. Количество одной из аминокарбоновых кислот, внесенных в составе этой смеси, например как раз той, которая разобщает два близких по своей подвижности [c.77]

Создается впечатление, что для фракционирования белков метод изотахофореза если и привлекателен, то скорее всего не в сфере научных исследований, а как метод рутинного контроля за сохранением пропорций уже известной белковой Ьмеси. Сюда относятся такие важнейшие сферы деятельности, как технологический контроль в пищевой промышленности или диагностика заболеваний по белковому составу физиологических жидкостей организма [Ое1тойе, 1977]. Немалые возможности открывает изотахофорез и для анализа смесей определенных низкомолекулярных веществ, например, в фармакологии—для контроля синтеза или очистки биологически активных пептидов, при изучении реакций метаболизма, а также в пищевой индустрии—для обнаружения примесей органическйх кислот и других ингредиентов в пищевых продуктах. Такого рода приложения выходят за рамки этой книги, поэтому изложенным выше мы ограничим свое знакомство с методом изотахофореза, по крайней мере до тех пор, пока он не продемонстрирует более убедительно свою пригодность для исследования белков и нуклеиновых кислот. [c.78]

В обычном варианте изотахофореза вся картина распределения компонентов движется вдоль пластинки. При попытке осуществить фракционирование из большого объема разбавленного препарата выясняется, что формирование последовательности узких белковых зон не успевает завершиться к моменту, когда граница лидирующего иона достигает конца пластинки. Авторам удалось остановить движение картины распределения относительно пластинки, сохранив сущность явления изотахофореза. Для этого они воспользовались принципом относительности движения, заставив всю жидкость, заполняющую сетку носителя, двигаться в обратном направлении с точно такой же скоростью, с какой мигрируют ионы обоих буферов и расположенные между ними белковые зоны, разделенные амфолннами. Таким образом картина распределения сохраняется неограниченно долго и белки из любого объема исходного препарата могут собираться в узкие зоны (практически для этого достаточно 4 ч), [c.78]

Изотахофорез — это третий метод разделения белков в электрическом поле. Простой электрофорез, осуществляемый в постоянном электрическом поле при постоянном pH, основан на разделении молекул по их истинной подвижности. В методе изоэлектрического фокусирования используется постоянное электрическое поле и градиент pH, что позволяет компонентам смеси двигаться до тех пор, пока они не станут электроней-тральными. В методе изотахофореза также создается градиент pH и все компоненты движутся в электрическом поле с одинаковыми скоростями, но напряженность электрического поля в точках локализации каждого компонента различна. Разделение происходит на основе различий в подвижности компонентов (подвижности на единицу напряженности поля), тогда как истинные скорости каждого компонента остаются идентичными. Чтобы получить различную напряженность электрического поля в разных точках, не требуется какого-то сложного оборудования для управления градиентом напряжения. Система является самоформирующейся (так же, как и система создания градиента pH при изоэлектрическом фокусировании), при условии что отсутствует избыток токопроводящих ионов, которые могли бы разрушить границы между компонентами. В отсутствие ионов с промежуточной подвижностью два типа одинаково заряженных ионов, имеющих разную подвижность, будут разделяться до тех пор, пока все ионы, движущиеся быстрее, не ока- [c.231]

Поскольку полосы всех компонентов вынуждены перемещаться с одинаковой скоростью, тогда как подвижность ы, этих компонентов различна, самопроизвольно устанавливается градиент напряжения , именно благодаря этому истинная скорость (EiXUi) движения всех компонентов оказывается одинаковой. Это приводит к тому, что напряжение вдоль изотахофо-ретической колонки изменяется сложным образом, как показано на рис. 5.25. На границах между компонентами наблюдается резкое падение напряжения, и, поскольку это влияет на кон-цент1рацию протонов, промежуточные значения pH также изменяются. В теории изотахофорез осуществляется при постоянном значении pH, если в системе присутствует достаточно сильный буфер. На практике же возникает некоторый градиент pH белки, обладающие более высокой подвижностью при начальном значении pH, движутся в область более низких значений pH и становятся менее подвижными. Таким образом, саморегулирование подвижностей обусловлено двумя эффектами разностным градиентом напряжения и градиентом pH, вызывающим снижение подвижности наиболее подвижных компонентов. Ка- [c.233]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология