Ферменты активность экзонуклеазная

Термостабильные ДНК-полимеразы, у которых отсутствует 3 5 -экзонуклеазная активность, включают в оба конца продукта ПЦР независимо от матрицы 3 -выступающий остаток dA [103]. Это обстоятельство препятствует непосредственному клонированию продуктов ПЦР по тупым концам линеаризованного вектора и требует предварительного удаления выступающих остатков с помощью ферментов, обладающих экзонуклеазной ак- [c.77]

ДН К-полимераза o имеет молекулярную массу около 150 кД и состоит из двух неидентичных субъединиц. Этот фермент обладает сопряженной З -экзонуклеазной активностью. Его роль в синтезе ДНК не ясна. [c.51]

Репликация лучше всего изучена у Е. соИ. У этого организма есть три ДНК-полимеразы (I, П и HI). Все три фермента и их аналоги из других бактерий обладают корректирующей экзонуклеазной активностью. [c.48]

ДНК-полимераза I состоит из одного полипептида длиной 911 аминокислотных остатков (а. а.) (Air=102 000 D). Этот фермент отличается от прочих ДНК-полимераз Е. соИ наличием З -экзонуклеазной активности. Фактически ДНК-полимераза I — это два фермента на одной полипептидной цепи ограниченный протеолиз расщепляет эту ДНК-полимеразу на большой и малый фрагменты с разными активностями. Большой субфрагмент ДНК-полимеразы I (называемый также ДНК-полимеразой Кленова или фрагментом Кленова) обладает полимеризующей и З -экзонуклеазной (корректирующей) активностями. Малый субфрагмент несет З -экзонуклеазную активность, 5 -экзонуклеаза ДНК-полимеразы I действует на 5 -конец полинуклеотидной цепи только в составе дуплекса и отщепляет от него как моно-, так и олигонуклеотиды. Направление действия 5 -экзонуклеазы совпадает с направлением полимеризации новой цепи ДНК, т. е. в ходе полимеризации экзонуклеаза расчищает дорогу для полимеразы (рис. 29). Подобные свойства ДНК-полимеразы I соответствуют ее функциям в клетке эта полимераза удаляет различного рода дефекты из ДНК в ходе репарации и служит вспомогательной поли- [c.48]

З -ОН-группа концевого рибонуклеотида этой короткой цепи РНК служит затравкой для синтеза ДНК под действием ДНК-поли-меразы П1. По матрице материнской ДНК точно синтезируется комплементарная цепь дочерней ДНК в направлении 5 —> 3 (у прокариот — 1000-2000 нуклеотидов, в животных клетках — 150-200 нуклеотидов). Точность синтеза определяется тем, что фермент редактирует синтезированную цепь если ДНК-полимераза встраивает неправильный нуклеотид, то фермент сам может распознать неспособность этого нуклеотида образовать правильную пару с соответствующим нуклеотидом матричной цепи. В этом случае фермент возвращается назад и отщепляет неправильный нуклеотид с З -конца цепи за счет экзонуклеазной активности, после чего ДНК-полимераза продолжает присоединять правильные нуклеотиды в направлении 5 -> 3. В результате достигается высокая точность матричного синтеза (не более одной ошибки на 1—10 млрд нуклеотидных остатков). Аналогичный процесс происходит и на второй расплетенной цепи ДНК синтез праймера и затем дочерней цепи ДНК в направлении 5 -> 3. Поскольку цепи антипараллельны, то на первой рост цепи совпадает с направлением движения репликативной вилки, а на второй — идет в противоположном направлении. [c.303]

РНК-затравочные участки не сохраняются в структуре зрелой ДНК. После реализации своей функции для инициации репликации ДНК они удаляются за счет проявления 5 З -экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы (рис. 13.1, и 13.3). После удаления РНК-затравки и ее замещения на фрагмент ДНК, инициация синтеза которого происходит на следующей РНК-затравке, расположенной ближе к области репликативной вилки, между дву Мя соседними синтезированными фрагментами ДНК остается разрыв. Этот разрыв (отсутствие ковалентной связи между З -ОН- и 5 -Р04-концами фрагментов цепи) устраняется при участии фермента-ДНК-лигазы,-направляющего образование фосфодиэфирной связи (рис. 13.4). [c.107]

I обладает также 5 -> З -экзонуклеазной активностью, т.е. способен последовательно отщеплять 5 -нуклеотиды от цепи ДНК, связанной с матричной цепью. На рис. 13.7 изображена модель структуры ДНК-поли-меразы I с указанием расположения соответствующих функциональных центров. Особые ферментативные свойства ДНК-полимеразы I сделали этот фермент эффективным и весьма распространенным инструментом для изучения нуклеиновых кислот (см. Дополнение 13.1). [c.112]

Псевдомонада Alteromonas espejiana сегрегирует единственную дезоксирибонуклеазу, получившую название й/31. В отношении одноцепочечной ДНК, в том числе одноцепочечных участков двухцепочечной ДНК, Balil ведет себя как эндонуклеаза, действуя аналогично другим эндонуклеазам, специфичным к одноцепочечным ДНК. Однако в отношении интактной двухцепочечной ДНК этот фермент проявляет экзонуклеазную активность, по-ви- [c.213]

РИС. 15-30, Схематический рисунок, показывающий три типа ферментативной активности ДНК-полимеразы I. Верхний рисунок иллюстрирует 3 -5 -экзонуклеазиую или корректирующую активность фермента. Хотя на рисунке показано, что фермеит передвигается иа одно положение вперед до того, как произойдет следующий этап, иа самом деле момент, когда происходит передвижение, ие установлен. Нижний рисунок иллюстрирует реакцию полимеризации и 5 -3 -экзонуклеазное действие. [c.275]

Чтобы обеспечить образование непрерывной цепи ДНК из многих таких фрагментов, в действие вступает особая система репарации ДНК, удаляющая РНК-затравку и заменяющая ее на ДНК. У бактерий РНК-затравка удаляется нуклеотид за нуклеотидом благодаря 5 -> З -экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы. При этом каждый отщепленный рибонуклеотидный мономер замещается соответствующим дезоксирибонуклеотидом (в качестве затравки используется З -конец синтезированного на старой цепи фрагмента). Завершает весь процесс фермент ДНК-лигаза, катализирующий образование фосфодиэфирной связи между группой З -ОН нового фрагмента ДНК и 5 -фосфатной группой предыдущего фрагмента. Образование этой связи требует затраты энергии, к-рая поставляется в ходе сопряженного гидролиза пирофосфатной связи кофермента-никотинамидадениндинуклеотида (в бактериальных клетках) или АТФ (в животных клетках и у бактериофагов). [c.253]

Поврежденный участок ДНК вырезается и застраивается заново с использованием комплементарной цепи в качестве матрицы. > Е. сэИ ДНК-полимеразой, участвующей в репарации, служит ДНК-полимераза I. В ряде случаев этот же фермент может выполнять функции экзо-иуклеазы за счет своей о -> З -экзонуклеазной активности) [c.77]

Как уже было сказано, ряд фагов (фХ174, 04, М13 и др.) имеют однонитевой кольцевой гено.м. Вскоре после попадания такого генома в клетку он превращается в кольцевой ковалентно-непрерывный дуплекс (или, как говорят, в репликативную форму) Это превращение включает ряд стадий 1) образование затравки 2) элонгацию комплементарной цепи, осуществляемую клеточной ДНК-полимеразой П1 3) удаление РНК-затравки, которое производится, по-видимому, за счет З -экзонуклеазной активности клеточной ДНК-полимеразы I 4) достраивание комплементарной цепи 5) лигирование концов комплементарной цепи ДНК-лигазой и 6) внесение сверхспиральных витков в ковалентно-непрерывный дуплекс при помощи гиразы. Обратим внимание, что все ферменты, обеспечивающие перевод родительского генома в репликативную форму, имеют клеточное происхождение. [c.272]

ДНК-полимераза бактериофага Т4 получается из клеток Е. oli, инфицированных бактериофагом Т4. Фермент обладает ДНК-по-лимеразной и значительно более высокой по сравнению с ДНК-полимеразой I 3 -> 5 -экзонуклеазной активностью, но, в отличие от последней, не проявляет 5 -> З -экзонуклеаэную активность. [c.351]

ДНК-полимераза Т4 может быть использована в основном так же, как ДНК-полимераза I, Сильная 3 -> 5 -экзонуклеазная активность позволяет применять фермент для введения метки в ДНК без выступающих концов и с З -аыступающими концами. [c.351]

Этот фермент найден в небо,льших количествах, причем он тесно связан с ДНК-нолимеразой Е. oli. Разделение этих двух ферментов производится при помощи хроматографии на бумаге. Экзонуклеазное действие этого фермента весьма сходно с действием экзонуклеазы II из Е. oli. Однако, помимо этого, экзонуклеаза III проявляет активность фосфатазы, высокоспецифичной для фосфатных остатков, этерифицированных по концевым 3 -гидроксильным группам цепи ДНК (фиг. 41). Экзонуклеаза III [c.95]

ДНК-зависимая ДНК-полимераза (К. Ф. 2. 7. 7. 7.) — ДНК-нуклеотидилтранс-фераза, или фермент Корнберга (ДНК-полимераза 1), осуществляющий полимеризацию дезоксирибонуклеозидтрифосфатов на ДНК-матрице в присутствий ионов Выделенный из кишечной палочки после тщательной очистки фермент представляет собой препарат, гомогенный по критериям седиментации, хроматографии и электрофореза в крахмальном геле. Наряду с полимеразной активностью фермент обладает также экзонуклеазной активностью. [c.50]

После завершения синтеза фрагмента Оказаки РНК-затравка (праймер) удаляется (нуклеотид за нуклеотидом) с помощью 5 - 3 -экзонуклеазной активности ДНК-полимеразы I. По мере отщепления рибонуклеотидных мономеров каждый из них замещается на соответствующий дезоксирибонуклеотид в ходе полимеразной реакции, осуществляемой ДНК-полимеразой I (при этом в качестве затравки используется З -конед предыдущего фрагмента Оказаки). Новый фрагмент Оказаки присоединяется к отстающей цепи ДНК с помощью фермента ДНК-лигазы. Источником энергии для этой реакции у эукариот служит АТФ. ДНК-лигаза не может соединить две молекулы одноцепочечной ДНК. Цепи ДНК, соединяемые ДНК-лигазой, должны быть частью двухцепочечной молекулы ДНК. [c.304]

Е. соИ или фага Т4. ДНК-полимераза I обладает способностью удлинять цепь ДНК в направлении 5 3 путем присоединения комплементарного нуклеотида. Это свойство ДНК-полимераз используется в генной инженерии для построения второй комплементарной цепи при добавлении фермента к одноцепочечной ДНК-матрице в присутствии праймера произойдет ее удвоение. Это свойство используется, например, при создании кДНК-библиотек. ДНК-полимераза применяется также для заполнения бреши в цепи ДНК, например, при застраивании фрагментов с выступающими 5 -концами. Экзонуклеазная активность ДНК-полимераз используется для введения радиоактивной метки во фрагмент ДНК. [c.24]

ДНК-полимераза I представляет собой необычный фермент с несколькими активностями. Она содержит один полипептид с мол. массой 109 000 дальтон. При протеолитической обработке полипептидная цепь делится на два отрезка. Большой фрагмент (76 ООО дальтон) проявляет 5 —З -полимеразную и 3 —5 -экзонуклеазную активности. Малый фрагмент (36 ООО дальтон) обладает другой активностью - 5 —З -экзонуклеолитической. Последняя поэтому оказывается независящей от синтезирующей (исправляющей ошибки) активности. С помощью. i —З -экзонуклеазной активности вырезаются небольшие участки, содержащие до 10 нуклеотидов, [c.415]

ДНК-полимераза гена 43 обладает обычной 5 —З -синтетической активностью, связанной с 3 —З -экзонуклеазной корректирующей активностью (гл. 32.) Оставшиеся три белка отнесены к полимеразным вспомогательным белкам . Продукт гена 45 является димером. Продукты генов 44 и 62 образуют прочный комплекс, который характеризуется АТРазной активностью и тем, что он увеличивает скорость движения ДНК-полимеразы в 3 раза, от 250 до примерно 800 нуклеотидов/с последнее значение близко к скорости движения ДНК-полимеразы in vivo ( 1000 нуклеотидов/с). Увеличение в скорости не зависит от того, используется одно- или двухцепочечная матрица. В тех случаях, когда ДНК-полимераза фага Т4 работает на одноцепочечной матрице ДНК, скорость ее движения непостоянна. Фермент быстро передвигается в пределах одноцепочечных областей, однако при прохождении через области, имеющие вторичную структуру, образуемую спарившимися внутри цепи основаниями, движение его замедляется. Прохождению ДНК-полимеразы через такие участки способствуют вспомогательные белки. Их роль заключается в увеличении скорости репликации в трудных областях и, следовательно, в поддержании равномерности движения ДНК-полимеразы. Присутствие белков увеличивает сродство ДНК-полимеразы с ДНК, а также ее способность удерживаться на матричной молекуле без диссоциации. Возможно, что белки действуют как зажим , удерживая ДНК-полимеразную субъединицу на матрице более прочно. Для такого эффекта необходимо совместное действие всех трех белков. Подобный тип взаимоотношений оставляет открытым вопрос о том, что является компонентом ДНК-полимеразы, а что-вспомогательным фактором. [c.428]

С, кодирующие компоненты репарационной эндонуклеазы. Первичная характеристика ферментативной активности позволяет предполагать, что эндонуклеаза узнает тиминовый димер (или другие искажения) и делает первоначальный разрез на его 5 -стороне другой разрез производится с З -стороны примерно на расстоянии 12 нуклеотидов. Определенные ферменты Е. oli могут вырезать тиминовые димеры in vitro из ДНК, в которой уже сделаны разрезы. Такой 5 —З -экзонуклеазной активностью обладают ДНК-полимераза I и ДНК-полимераза II (см. табл. 32.2) и экзонуклеаза III, специфичная в отношении одноцепочечной ДНК. Однако мутации, по- [c.439]

ДНК-полимераза I (или Pol I) Е. oli находит широкое применение в работе с рекомбинантными ДНК и при определении нуклеотидной последовательности ДНК. Одно из важнейших применений этого фермента связано с введением радиоактивной метки в ДНК in vitro с помошью так называемой ник-трансляции, направляемой ферментом за счет сопряженных полимеразной и 5 З -экзонуклеазной активностей. Этот процесс позволяет добиться необычайно высокого включения радиоактивной метки в ничтожные количества ДНК, т. е. получать препараты с гораздо более высокой удельной активностью (оцениваемой в импульсах в минуту на 1 мкг ДНК), чем при введении метки in vivo. Радиоактивные ДНК-зонды, полученные с помощью ник-транс- [c.113]

I протеиназой субтилизином, происходит расщепление фермента на два крупных полипептида, один из которых проявляет 5 3 экзонуклеазную активность, а другой содержит каталитический центр полимеризации. Последний фрагмент (известный как фрагмент Клёнова) сохраняет полимеразную активность и может быть полностью очищен от примеси 5 -> -> З -экзонуклеазного фрагмента. [c.116]

На первый взгляд казалось, что это наблюдение свидетельствует о функциональной заменимости ДНК-полимеразы I. Однако дальней-щие исследования показали, что мутация pol А не затрагивает 5 З -экзонуклеазной активности Pol I. Удалось получить добавочные температурочувствительные мутации гена polA, подавляющие 5 -> З -экзонуклеазную активность и летальные при рестриктивной температуре. На основании этих данных был сделан вывод о том, что 5 З -экзонуклеазная активность Pol I является жизненно важной функцией, необходимой для удаления РНК-затравок при репликации, т.е. для обеспечения нормального синтеза полноценной отстающей цепи ДНК (рис. 13.3). В действительности для исходного ро/Л-мутанта было показано, что фрагменты Оказаки встраиваются в протяженные участки цепи ДНК с некоторым запаздыванием, и это свидетельствовало о возможном участии ДНК-полимеразы I в заполнении пустот, возникающих после удаления РНК-затравок из отстающей цепи. В то же время эту функцию Poll нельзя назвать жизненно важной, поскольку в polA-мутантном штамме с ней вполне успешно справляется фермент Pol 1П. [c.116]

Эукариотические ДНК-полимеразы не обладают 3 -> -> 5 -экзонуклеазной активностью и обусловливают гораздо более высокую частоту возникновения ошибок при репликации ДНК фага фХ174 in vitro. При одинаковых условиях для эукариотических полимераз наблюдались следующие частоты 3-10 для ДНК-полимеразы а (Pol а), 1,2-3,0 -10 для ДНК-полимераз Р и у- Очевидно, что для обеспечения необходимой точности репликации в эукариотических клетках должны присутствовать дополнительные ферменты, повышающие точность этого процесса. Некоторые биохимические данные свидетельствуют о наличии у эукариот фермента с 3 -> 5 -экзонуклеазной активностью, действующего в контакте с ДНК-полимеразой а. Этот фермент может обеспечивать корректорскую функцию in vivo, утрачиваемую в ходе очистки ДНК-полимеразы а. [c.122]

Смотреть страницы где упоминается термин Ферменты активность экзонуклеазная: [c.48] [c.49] [c.77] [c.431] [c.277] [c.48] [c.49] [c.77] [c.181] [c.195] [c.351] [c.351] [c.903] [c.905] [c.923] [c.424] [c.302] [c.418] [c.116] [c.117] [c.121] [c.122] [c.290]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология