Ферментативное секвенирование

Наиболее широко сейчас применяется метод ферментативного секвенирования, или метод секвенирования путем терминации (остановки синтеза) цепи, предложенный Ф. Сэнгером в 1977 г. (рис. 1.3, а). В основе [c.30]

Хотя сам принцип специфической терминации, положенный в основу первоначального метода секвенирования ДНК с помопц.ю дидезок-ситерминаторов, остался неизменным, само секвенирование ДНК по Сэнгеру все же стало в значительной степени другим. Причем для описания всех этих последовательных усовершенствований одной главы оказалось недостаточно и, кроме главы 2, целиком посвященной этому методу, еще ряд глав (глава 3. ПЦР-секвенирование ДНК глава 9. Автоматическое секвенирование ДНК) имеют к ферментативному методу секвенирования ДНК самое непосредственное отношение. Разработки векторов для молекулярного клонирования и стратегий секвенирования (главы 7 и 8 соответственно) также в большей степени ориентированы на ферментативное секвенирование. В связи с разделением нами в главе 7 векторов для молекулярного клонирования на несколько поколений следует отметить, что оно, конечно же, условно хотя бы по той причине, что огромная группа специализированных векторов оказалась не включенной в приведенную схему. Подробное рассмотрение стратегий секвенирования объясняется тем, что именно от их выбора часто зависит общая производительность метода секвенирования ДНК. [c.10]

Ввиду большого объема информации анализ нуклеотидной последовательности ДНК уже давно немыслим без компьютера и без банков данных. Современный молекулярный биолог должен хорошо разбираться в возможностях, предоставляемых ему той или иной программой, а также уметь пользоваться для этих целей сетью Интернет, что кратко изложено в главе 10. Глава 11 посвящена грандиозным успехам всей молекулярной биологии в виде расшифровки первичных последовательностей геномов разных свободноживущих организмов. В ней приводятся сведения в этой области по состоянию на конец ноября 1998 г. Несколько отличающиеся от классического метода ферментативного секвенирования подходы описаны в главе 12. Некоторые из них обладают значительным потенциалом. Глава 13 посвящена еще одному способу секвенирования ДНК с помощью гибридизации, где вклад отечественных ученых во главе с академиком А.Д. Мирзабековым особенно значителен. В заключительной, 14-й, главе нами осуществлена попытка отобразить изменения методов секвенирования ДНК, произошедшие с ними за эти годы и описанные в данной книге. [c.11]

Выше на рис. 2.2 схематично показан весь описанный выше процесс, но следует отметить, что он несколько идеализирован. При его выполнении экспериментаторов подстерегает множество нюансов, которые могут свести на нет все предварительные усилия. Так, и подготовка самой матрицы к секвенированию, и выбор затравочной молекулы, и определенное соотношение дНТФ/ддНТФ, зависящее, главным образом, от используемой ДНК-полимеразы, и мечение вновь синтезируемой цепи ДНК, и параметры секвенирующего геля, и даже особенности радиоавтографии зависят от конкретных задач и требуют тщательного исполнения. В этой связи последующие разделы этой главы и некоторые другие главы будут посвящены подробному анализу составляющих процесса ферментативного секвенирования ДНК. [c.48]

Поскольку в основе метода ферментативного секвенирования лежит построение новой комплементарной цепи ДНК по уже имеющейся, то большое значение приобретает подготовка молекул ДНК для осуществления этого процесса. Так, если для метода секвенирования ДНК химической деградацией было необходимо наличие одно- или двуцепочечного фрагмента, нe 5ш eгo на одном (гомогенном) из своих концов единственную метку, то для секвенирования ферментативным методом необходимо наличие немеченной матрицы ДНК и при этом желательно одноцепочечной. Хотя, справедливости ради, следует отметить, что матрица ДНК, несущая какую-либо метку (включая и радиоактивную), в большинстве случаев не окажет заметного влияния на заключительный радиоавтограф из-за большой разницы в размерах самой матрицы и вновь синтезированной в условиях терминации цепи ДНК. Что касается матрицы ДНК, один из концов которой несет метку в виде молекулы биотина, то в этом случае возможна ее сорбция на твердой фазе, например, на магнитных частицах со стрептавидином и проведение так называемого твердофазного секвенирования. При этом выхода биотинилированной метки в заключительный раствор терминирующей смеси, содержащей комплементарную цепь ДНК, меченную уже как-то по-другому и предназначенную для нанесения на секвенирующий гель, даже не произойдет. [c.48]

Несмотря на то, что с помощью фаговых или фагмидных векторов получение одноцепочечных молекул ДНК не представляло особых проблем, желание не тратить на очистку одноцепочечной ДНК от прочно связанных фаговых белков заставляло исследователей разрабатывать подходы к секвенированию двуцепочечных молекул ДНК, не останавливаясь даже перед фактом, что качество получаемых результатов при секвенировании двуцепочечной ДНК всегда заведомо хуже, чем одноцепочечной. (Здесь понятия качество секвенирования и количество определенных при этом нуклеотидов очень тесно связаны, поскольку при более высоком качестве полос на радиоавтографе секвенирующего геля прочитать можно будет гораздо большее их количество.) Так, не взирая на потенциально худшие результаты, большое число работ посвящено описанию различных подходов по подготовке двуцепочечных матриц ДНК, пригодных для ферментативного секвенирования дидезокси-методом. Такой, казалось бы, неразумный подход объясняется повышением общей производительности всего процесса секвенирования ДНК за счет экономии времени как на очистку одноцепочечных матриц ДНК, так и на проведение необходимого переклони-рования вставки в специальный фаговый или фагмидный вектор. [c.54]

Как можно видеть из приведенных схем, наибольшее число консервативных участков локализовано в имеющемся у всех ферментов (что вполне естественно) домене, отвечающем за полимеразную активность. Некоторые из этих участков связываются с ДНК, а другие с дНТФ и ионами магния. Этому домену предшествует домен, выполняющий редактирующие функции в виде 3 — 5 -экзонуклеазной активности. У термостабильных ДНК-полимераз в этом домене имеется только один консервативный участок (Taq ДНК-полимераза) или они все отсутствуют (Bst ДНК-полимераза), вследствие чего оба этих фермента лишены подобной редактирующей активности. КН2-терминальный домен у ДНК-полимеразы I несет репарирующую 5 — З -экзонуклеаз-ную активность. Подобную активность проявляют обе упомянутые выше термостабильные ДНК-полимеразы, что, вероятно, объясняет обнаруженную у них некоторую гомологию этого участка с аналогичным у ДНК-полимеразы I. Что касается большинства ДНК-полимераз, модифицированных с целью их большей пригодности для ферментативного секвенирования ДНК либо ограниченным протеолизом, либо специально созданных генно-инженерным путем, то их объединяет общая черта, заключающаяся в удалении имеющейся у их предшественников 5 — 3 -экзонуклеазной активности. Путем делеции нескольких аминокислотных остатков во втором экзонуклеазном домене Т7 ДНК-полимеразы была убрана имевшаяся 3 — 5 -экзонуклеазная активность. Сайтнаправленный мутагенез двух аминокислот в экзонуклеазном домене Кленовского фрагмента ДНК-полимеразы I привел к удалению 3 —> 5 -экзонуклеазной активности этого фермента. Как можно представить из приведенных схем, столь разные структурные организации рассматриваемых ферментов не могли не сказаться на особенностях их ферментативного действия, чему и будет посвящено дальнейшее изложение. [c.83]

Хотя в литературе встречаются и более ранние упоминания об использовании при ферментативном секвенировании ДНК меченых праймеров [Hong, 1982]. К недостаткам этого способа можно отнести наличие лишь единичного атома радионуклида в каждом секвенируемом фрагменте ДНК, тогда как в предыдущих вариантах мечения коли- [c.102]

В середине 1980-х годов возник метод ферментативного секвенирования ДНК без использования уже привычных дидезоксинуклеотидов в качестве терминаторов строящейся цепи ДНК [Labeit et al., 1986 Labeit et al., [c.118]

Определение последовательности нуклеотидов рассмотренными выше методами предполагает разделение продуктов секвенирующих реакций (как полученных в ходе ферментативного секвенирования, так и в процессе химической деградации) с помощью высоковольтного секвенирующего электрофореза в полиакриламидном геле. Сразу следует отметить, что этот метод претерпел целый ряд всевозможных улучшений и модификаций, направленных, главным образом, на повышение его разрешающей способности, рассмотрение которых и будет основной темой данной главы, поскольку сам принцип электрофореза детально изложен во многих обзорах и целых книгах и рассматривать его здесь, видимо, будет излишним. [c.168]

Что касается ферментативного секвенирования ДНК по Сэнгеру, то этот метод изменился за эти годы весьма сильно и разработанные стратегии секвенирования протяженных фрагментов ДНК оказали заметное влияние на его общую производительность. Большинство существующих стратегий секвенирования протяженных фрагментов ДНК ферментативным методом основаны на получении серии субклонов. Различают два главных подхода к их получению, один из которых считается случайным, а другой направленным. В основе стратегий случайного подхода лежит произвольная фрагментация ранее клонированного фрагмента ДНК и дальнейшее получение субклонов с небольшими вставками в другом векторе (а не в исходном), причем их размер, как правило, позволяет осуществить определение нуклеотидной последовательности всего субклонированного фрагмента за один эксперимент без дополнительного этапа субклонирования. Стратегии направленного подхода предполагают создание серии субклонов обычно в составе исходного вектора, различающихся размером делетированных участков вставки между сайтом какой-либо подходящей полилинкерной рестрикционной эндонуклеазы, предшествующим сайту клонирования (со стороны отжига секвенирующего праймера), и прогрессивно удаляющимися местами вставки. И тот и другой подходы имеют как свои преимущества, так и недостатки, к рассмотрению которых мы и перейдем. [c.240]

Первые успехи в автоматизации секвенирования ДНК, пожалуй, можно связать с полуавтоматическими и автоматическими методами. чтения последовательности нуклеотидов с радиоавтографа секвенирующего геля или даже еще с более ранней автоматической обработкой и анализом последовательности нуклеотидов с помощью компьютеров и специализированных программ. Однако в настоящее время под автоматическим секвенированием ДНК понимается, в первую очередь, электрофоретическое разделение флуоресцентно меченных продуктов терминирующих реакций с помощью специальных приборов - автоматических секвенаторов ДНК. Другой аспект автоматизации процесса секвенирования ДНК заключается в наработке матриц для их последующего ферментативного секвенирования, а также проведении секвенирующих реакций (как в ферментативном методе, так и в методе химической деградации) с помощью лабораторных биороботов. [c.309]

Под автоматическим секвенированием ДНК понимается в первую очередь электрофоретическое разделение меченых продуктов терминирующих реакций с помощью специальных приборов — автоматических секвенаторов ДНК. Автоматизации с помощью лабораторных биороботов подвергаются также процесс наработки матриц для их последующего ферментативного секвенирования и проведение секвени-рующих реакций. Первый автоматический ДНК-секвенатор был разработан в 1987 г. фирмой Applied Biosystems (США). [c.42]

Сейчас, наверное, невозможно назвать точную дату выполнения химиками-профессионалами первого полученного ими заказа по синтезу конкретных олигонуклеотидов. Одно можно сказать с уверенностью, что заказной синтез олигонуклеотидов стал носить массовый характер только после появления метода ПЦР, так как до этого праймеры использовались преимущественно лишь при ферментативном секвенировании ДНК, для которого применялся довольно ограниченный набор векторных молекул и существовало соответственно еще меньшее количество различных мест отжига праймеров на этих векторах, поскольку разные типы векторов могут нести одинаковые участки для посадки затравочных молекул. Более того, практически все используемые в секвенировании ДНК праймеры можно было легко купить, так как они фигурировали в каталогах большинства фирм-производителей молекулярно-биологических реактивов и препаратов. Надо сказать, что эта ситуация сохранилась и поныне, и наряду с заказным синтезом, например, стандартного секвенирующего праймера экспериментатор имеет возможность приобрести как реактив готовый олигонуклеотид с такой же последовательностью (но уже дороже ). [c.72]

Смотреть страницы где упоминается термин Ферментативное секвенирование: [c.31] [c.44] [c.48] [c.51] [c.52] [c.55] [c.79] [c.86] [c.87] [c.92] [c.104] [c.117] [c.151] [c.269] [c.284] [c.296] [c.313] [c.388] [c.395] [c.398] [c.324]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология