Химотрипсин иммобилизации

Ковалентная иммобилизация а-химотрипсина в полиакриламидном геле. Процедура иммобилизации включает две стадии модификацию хлорангидридом акриловой кислоты и включение в гель. [c.148]

Каким образом могут влиять на активность ферментов некоторые свойства носителей или тип присоединения фермента и насколько сильно это влияние, показано ниже на нескольких примерах. Один из наиболее важных факторов — состав реакционноспособных групп. Датта и Оллис [10] исследовали зависимость удельной активности иммобилизованного а-химотрипсина от концентрации гидразидных групп на поверхности гранул биогеля Р-2 (рис. 12.1). Обнаружено, что кривая зависимости имеет острый максимум. На химотрипси-не, лизоциме и липазе изучались изменения удельной активности не только после их иммобилизации, но одновременно и после обработки растворимыми аналогами носителей с теми же химическими группами, которые использовались для связывания белка с поверхностью носителя. Во всех случаях наблюдалась корреляция поведения модифицированных ферментов в растворимом состоянии и в иммобилизованном виде. Манеке и Фогт [33] исследовали количество иаиаи-на, связанного с носителями на основе поливинилового спирта, в зависимости от концентрации на носителе реакционноспособных диазониевых групп. Как следует из табл. 12.2, с возрастанием количества реакционноспособных групп носителя количество связанного папаина проходит через максимум, в то время как относительная активность постепенно понижается. Одной из причин такого уменьшения активности может быть неблагоприятное влияние многоточечного присоединения молекул фермента к носителю, который содержит избыток реакционноспособных групп. Подобные результаты были получены также с иммобилизованным ненсином [53]. Препараты, содержащие 13 мг связанного пепсина на 1 г сухого носителя, имели относительную протеолитическую активность 92,8%, содержащие 46,8 мг/г — 65,7%, 50,8 мг/г — 45,3%, а 65 мл/г — 37,8%. [c.425]

Иммобилизация позволяет изучать ферменты в условиях, которые обычно приводят к нх агрегации. Иммобилизация химотрипсина на стекле позволила Танизава и Бендеру [49] исследовать влияние апротонных дшюлярных органических растворителей на кинетику катализируемого химотрипсином гидролиза в условиях, приводящих к агрегации свободного химотрипсина. В ходе этого исследования было найдено, что кажущиеся константа Михаэлиса Кт(каж) и константа скорости деацилирования з(каж) существенно зависят от концентрации органического растворителя. [c.437]

Оптимальные условия связывания, pH, состав буферного раствора и температура, в значительной степени зависят от характера аффинного лиганда. Наиболее эффективно реакция проходит при pH 8—10, однако, если этого требует природа аффинного лиганда, можно использовать и более низкие значения pH. Аффинный лиганд, особенно белковой природы, растворяют в буфере с высокой ионной силой (около 0,5), чтобы предотвратить неспецифическую сорбцию, например белка на белке, которая обусловлена полиэлектролитной природой белков. Для последующей отмывки сорбента используются растворы с более высокой ионной силой. Можно применять карбонатные или бо- ратные буферы с добавкой хлорида натрия. Количество присоединенного лиганда зависит от соотношения в реакционной смеси аффинного лиганда и объема геля, pH, природы самого лиганда (числа реакционноспособных групп и т. д.), а также от длительности проведения реакции и температуры. Например, при иммобилизации химотрипсина к 2 мл NBr-акти Вированной сефарозы при pH 8 присоединяется только 5 мг из 10 мг взятого белка, из 20 мг белка связывается примерно 8 мг, а из 30 мг — примерно 10 мг. При комнатной температуре (20— 25 °С) связывание обычно завершается за 2 ч, при пониженной температуре рекомендуется увеличить длительность реакции до 16 ч, т. е. оставлять реакционную смесь на ночь. В процессе связывания реакционную массу необходимо перемешивать, но применять магнитную мешалку не рекомендуется, так как при таком перемешивании можно разрушить гель. Лучше всего перемешивать реакционную смесь встряхиванием. Когда реакция закончится, гель переносят на пористый стеклянный фильтр и промывают тем же буферным раствором, в котором проводилось связывание. Оставшиеся активные группы рекомендуется блокировать, с этой целью гель обрабатывают 2 ч 1М этанола-мином при pH 8. Конечный продукт следует промыть 4—5 раз буферным раствором с высоким или низким pH. Например, можно использовать ацетатный (0,1 М, pH 4) или боратный буферный (0,1 М, pH 8,5) раствор, содержащий 1 моль/л хлорида натрия. Как уже упоминалось во введении, все нековалентно связанные соединения следует отмыть. [c.20]

Температурная устойчивость амидгидролаз и многих других ферментов может быть сильно увеличена при иммобилизации, т.е. химическом или сорбционном СБлзывании с нерастворимым носителем (см. обзор [2502]). В качестве примера укажем здесь лишь на иммобилизацию а-химотрипсина в структуре сшитого почиакртамидного геля. Удалось получить препарат фермента, выдерживающий длительное кипячение в оде [25031. [c.235]

Таким образом, с точки зрения возможностей ковалентной иммобилизации ферментов белковые молекулы удобно представить в виде своеобразных шариков с экспонированными наружу функциональными группами тиольными (цистеина), гидроксильными (алифатическими — серина и треонина, ароматическими — тирозина), карбоксильными (глутаминовой и аспарагиновой кислот, а также С-концевыми), гуанидиновыми (аргинина), имида-зольными (гистидина) и аминогруппами (е-лизина и а-, Л/ -кон-цевыми). Оценку количества тех или иных групп в различных белках в первом приближении можно сделать по данным, приведенным на рис. 13. Например, в таком небольшом белке, как трипсин или химотрипсин, с молекулярной массой около 25 ООО, должно быть до 10 остатков цистеина, около 30 алифатических ОН-групп, 3—7 остатков тирозина, 7—12 остатков аргинина, свыше Ю аминогрупп и 40 карбоксильных групп. Результаты такой оценки соответствуют известным экспериментальным данным. [c.84]

Гидрофобизация белков (на примере а-химотрипсина) для целей нековалентной иммобилизации на гидрофобных носителях (биомембранах). К 10 мл 0,1 М раствора Аэрозоля ОТ в октане добавляют 450 мкл 33 мМ боратного буфера, pH 9,0. Раствор интенсивно встряхивают в течение 1—2 мин, солюбилизуют в нем 20—50 мг препарата лиофилизованного фермента, затем добавляют 100 мкл раствора стеароилхлорида в 0,1 М Аэрозоле ОТ в октане (соотношение стеароилхлорид — белок составляет 2 1). Раствор перемешивают в течение 20—30 мин. [c.152]

Хорошо известно, что протеиназы, расщепляя денатурированные белки, способствуют очищению ран, и следовательно, их заживлению. В этом направлении, в клинической практике с помощью иммобилизованных протеиназ сделано многое. В качестве носителей для иммобилизации протеолитических ферментов наиболее употребимы волокнистые материалы на основе целлюлозы, поливинилового спирта, солей альгиновой кислоты, полиамидное и коллагеновое волокно. Готовят препараты, иммобилизованные также на гранулированных материалах — целлюлозных шариках, гранулах декстрана, предварительно гидролизованных шариках капрона. Применяют также препараты, изготовленные нековалентным включением фермента в растворимые целлюлозы, в медленно рассасывающийся коллаген. Готовят нити, в которые при формовании включают фермент и используют их в качестве шовного материала. Сравнительный анализ действия нативных и иммобилизованных протеиназ (в основном а-химотрипсина, трипсина, террилитина, субтилизи-на, коллагеназы) показал, что уже на 2—4-й день рана очищается от некротических масс и по крайней мере вдвое быстрее наступает грануляция. [c.132]

Радиационная графт-полимеризация полиакролеина на полиметилметакрилатовых иикросферах активирует частицы для последующей иммобилизации химотрипсина при эН 8,3 [8]. [c.81]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология