Иммуносорбенты получение и использование

Концентрация иммобилизованных антител. Эта величина является одним из основных параметров, варьированием которого можно оптимизировать чувствительность и длительность анализа. Для успешной разработки метода ИФА знание точного значения этой концентрации необязательно. В большинстве случаев экспериментатор оперирует понятиями количество, или концентрация иммуносорбента (при использовании гранулированных носителей) или концентрация белка при адсорбции (для непористых полимерных материалов). Точное знание концентрации необходимо в тех случаях, когда ставится задача изучения физико-химических характеристик взаимодействия антиген — антитело либо получения исходных данных для оптимизации схемы ИФА на ЭВМ. [c.217]

ПОЛУЧЕНИЕ ИММУНОСОРБЕНТОВ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ОЧИСТКИ АНТИТЕЛ [c.304]

Абсорбция должна проводиться на твердой фазе, что требует химического соединения (или пассивного связывания) адсорбирующих антигенов с нерастворимой основой (например, с дериватами целлюлозы, полистиролом, эритроцитами, и т. д.) или получения геля из перекрестно-связанного антигена. Получение и использование наиболее часто применяемых иммуносорбентов приведены ниже. [c.97]

Таблица 14-1. Иммуносорбенты, использованные для получения

Ранее был описан активированный перйодатом сефадекс (0-50 или 0-75) [6]. После присоединения иммуноглобулина и восстановления шиффовых оснований полученные иммуноадсорбенты характеризовались очень низким неспецифическим связыванием, но гели оказались механически весьма неустойчивыми и быстро забивались. Кроме того, гели имели очень низкую емкость, потому что антитела исключались из внутреннего объеме шариков. Хотя агароза имеет больший размер пор, этот гель активируется периодатным окислением в незначительной степени, так как реакция протекает только по концам цепей полисахаридных молекул. Однако периодатным окислением может быть активирована поперечно-сшитая агароза. В результате побочной реакции, сопровождающей процесс поперечной сшивки с эпихлорогидрином, на геле образуются гликоли. Периодатное окисление этих гликолей приводит к альдегидам, которые могут реагировать с аминогруппами белка. Образовавшиеся шиффовы основания могут быть далее восстановлены, как описано для других матриц. Иммуносорбенты, полученные таким путем, характеризуются очень хорошими хроматографическими свойствами, сочетая жесткость агарозных шариков с химической стабильностью и низким неспецифическим связыванием. Могут быть достигнуты высокие скорости потока даже при использовании таких хаотропных агентов, как 6,0 М солянокислый гуанидин [7]. [c.68]

Отсюда определенный интерес представляет использование в анализе иммуносорбентов, полученных путем аффинного связывания специфических антител с иммобилизованным на носителе антигеном. Связь антиген — антитело обратима, поэтому для предотвращения смывания антител с сорбента разработаны пути последующего ковалентного закрепления молекул, образовавших специфический комплекс на носителе. Для стабилизации комплекса эффективно применяются обычные сшивающие агенты глутаровый альдегид, диазиды, изоцианаты. Процедура иммобилизации включает инкубацию связанного с носителем антигена с антисывороткой, отмывку носителя, проведение реакции с сшивающим антигеном и заключительную отмывку для удаления избытка (рис. 24). Процесс может проводиться как в реакторах перемешивания, так и в колоночном режиме. Данный подход детально изучен на примере иммобилизации антител против сывороточного альбумина человека на сефарозном сорбенте. В результате такого связывания по крайней мере половина активных центров иммобилизованных антител способна принимать- участие в последующих реакциях с антигеном, что является недостатком метода. Однако [c.210]

В основе принципа аффинной хроматографии лежит отличительная особенность биологически активных веществ образовывать стабильные, специфические и обратимые комплексы. Если иммобилизовать один из компонентов комплекса, то получится специфический сорбент для второго его компонента, при этом, разумеется, предполагается, что соблюдаются все условия, необ.ходимые для образования этого комплекса. Связывающие участки иммобилизованных веществ должны сохранять хорошую стерическую доступность для второго участника комплекса даже после связывания с нерастворимым носителем и не должны деформироваться. Примерами первых специфических сорбентов, приготовленных путем ковалентного связывания с нерастворимым носителем, были иммобилизованные антигены (Кемпбелл и др. [5]) . Методы, созданные для присоединения антигенов и антител к нерастворимым носителям, были сразу же применены для получения иммобилизованных ферментов. В то же время ранее предложенный азидный способ привязки ферментов к целлюлозе [25] стал использоваться для приготовления иммуносорбентов. Параллельное развитие обоих направлений, основанных на использовании связывания биологически активных веществ с нерастворимыми носителями, наглядно демонстрируют названия первых обзорных статей Реакционноспособные полимеры и их использование для приготовления смол с антителами и ферментами (Манеке [23]), Водонерастворимые производные ферментов, антигенов и антител (Сильман и Качальский [39]) и Химия и использование производных целлюлозы для изучения биологических систем (Великий и Витол [47]). Оба направления продолжали развиваться параллельно и после открытия других более эффективных носителей и разработки методов связывания, позволяющих сохранять свойства иммобилизуемых веществ в растворе. [c.11]

Гомогенность и специфичность центров связывания моноклональных антител делают их особенно удобными для использования в иммуноаффинной хроматографии. В табл. 6.15 мы приводим высокоэффективный метод получения иммуносорбентов для колонок и их применения, а также различные варианты условий элюции, которые позволили нам очень эффективно с сохранением их биохимической активности очистить макромолекулы, обладающие высокой чувствительностью к воздействию оазличпых агентов и находящиеся в низкой концентрации. [c.196]

В период становления техники иммуносорбции (конец 50-х годов) внимание специалистов привлек амино-полистирол — коммерческий препарат низкой стоимости, который без особых затрат и потери рабочего времени мог быть использован в качестве носителя для фиксации белковых антигенов. В самом деле, аминогруппы амино-полистирола можно диазотировать нитритом натрия в разбавленной соляной кислоте. Затем с помощью реакции азосочетания в слабощелочной среде к полихмеру можно ковалентно присоединить любые белки, содержащие тирозин. Однако полученные таким способом иммуносорбенты связывали неспецифически значительные количества сывороточных иммуноглобулинов, видимо, за счет гидрофобных взаимодействий. От этого полимера как носителя пришлось отказаться. [c.244]

Достаточным критерием иммунологической чистоты белка можно считать образование только одной полосы преципитации при двойной радиальной иммунодиффузии (см. ниже), когда с испытуемым очищенным белком взаимодействует поливалентная антисыворотка, полученная в ответ на введение животному неочищенного белка. Здесь уместно напомнить, что даже идеальная очистка белка-антигена не гарантирует строгой однозначности иммунного ответа. У разных особей данного вида животного введение одного и того же, совершенно чистого антигена может вызвать различные иммунные ответы. В одном случае это может быть гиперпродукция практически гомогенной специфической популяции антител, в другом — ответ может оказаться поливалентным, так что в антисыворотке появится целый набор антител, способных связывать исходный антиген (но не только его). Этот набор иногда можно разделить электрофорезом или ИЭФ. О причинах поливалентного иммунного ответа было подробно сказано выше. Ввиду такой возможности иммунизацию, как уже упоминалось, следует проводить параллельно на нескольких животных, с тем чтобы иметь возможность выбора наиболее чистой моноспецифической антисыворотки. После этих необходимых замечаний можно рассмотреть заключительный этап очистки антител — использование иммуносорбентов. [c.109]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология