Белок связывание с моноклональными антителами

Таблица 6.15. Связывание моноклональных антител с белком А

Для выявления молекул клеточной поверхности, участвующих в межклеточной адгезии, белки плазматической мембраны солюбилизируют, отделяют друг от друга и каждую фракцию испытывают на способность нейтрализовать действие фрагментов антител, блокирующее агрегацию клеток (этапы 3 и 4). Затем фракции, проявившие такую способность, очищают и вновь тестируют до тех пор, пока не будет получен чистый белок (этот процесс на схеме не показан). Другой Иммунологический подход состоит в получении большого числа моноклональных антител (разд. 4.5.4) к антигенам клеточной поверхности и их скрининге для выявления тех, которые будут блокировать межклеточную адгезию. Оба иммунологических метода основаны на важном общем наблюдении простое нанесение на клеточную поверхность антител само по себе не препятствует нормальной клеточной адгезии адгезия блокируется только тогда, когда мишенями для связывания антител служат специфические молекулы клеточной [c.518]

Описанный в этой главе метод основывается на том, что клетки гибридом способны включать радиоактивную экзогенную метку в синтезируемые ими белки. Очищенные антитела стабильны и специфически связываются с любой клеткой-мишенью, живой или убитой, если эта клетка несет антигены, узнаваемые данными антителами. Тест связывания антител надежен, достаточно гибок и хорошо воспроизводим. Он позволяет получать количественные данные, причем результаты регистрируются автоматически. Примеры использования этого метода, приведен- ые в данной главе, полностью относятся к исследованиям аллоантигенов мышей, однако подобный подход применим ко всем типам клеток, для которых имеются соответствующие моноклональные антитела. [c.217]

Отбор по связыванию с лигандом. Анализ популяции фаговых частиц на наличие на их поверхности белков, взаимодействующих с ингибитором исходного фермента или моноклональными антителами (шАЬ) соответствующей специфичности, Может быть как самостоятельной задачей, так и хорошим мето- [c.345]

Узнавание характерных черт белка МНС-1 с помощью рецептора Т-киллеров отличается от узнавания того же белка антителами. Специально полученные моноклональные антитела к разным доме- нам белка МНС-1 взаимодействуют не с теми участками, которые узнают Т-киллеры, специфичные к тому же МНС-1. Одни мутант ные варианты МНС-1 теряют места связывания антител, но узнаются Т-киллерами. Другие мутантные варианты белка МН( -1, теряя способность взаимодействовать со специфичным Т-киллером, сохраняют детерминанты для антител. [c.46]

До настоящего момента мы рассматривали главным образом преимущества замены поликлональных антител моноклональными для целей иммунометрического анализа. Повышение чувствительности, специфичности и воспроизводимости результатов (для различных партий антител) является безусловным вкладом в арсенал существующих методов. Однако этим дело не исчерпывается. Становится все более очевидным, что моноклональные антитела обладают рядом уникальных свойств, которые невозможно было выявить при работе с поликлональными антисыворотками. Для моноклональных антител удалось изучить, как это делается обычно для любых других белков, зависимость их функциональной активности от таких параметров окружающей среды, как pH, ионная сила, температура, присутствие детергентов. Несомненно, компонентам поликлональной антисьшо-ротки присущи подобные свойства, которые, однако, из-за гетерогенности популяции молекул в таких,препаратах не поддаются четкому выявлению. Наблюдать влияние указанных факторов можно только при работе с химически однородной популяцией антител. В качестве примера можно рассмотреть влияние pH на связывание моноклональных антител с гормоном роста человека (ГРЧ) (рис. 24-5). При pH 7 наблюдается образование прочного комплекса антител с ГРЧ, который при pH 4 и ниже разрушается с высвобождением молекул гормона (Bartholomew et al., 1983). Другие моноклональные антитела к этому же гормону не обнаруживают подобных свойств, прочность их связывания с ГРЧ при изменении pH в указанном дйа- [c.395]

Весьма эффективным методом уточнения топографии мембранных белков, прежде всего точной локализации внемембранных участков, является использование моноклональных антител. Для получения гибридом использовались фрагменты бактериородопсина, полученные путем его расщепления протеолитическими ферментами. Наиболее ценными в этом случае оказались синтетические фрагменты коррелируя величину синтетического пептида и эффективность связывания соответствующего антитела, можно с высокой степенью достоверности зондировать выступающие из мембраны полипептидные петли. Ниже показана локализация различных антигенных детерминант молекулы бaктepиopoдoпtинa в пурпурной мембране (Г. Корана, И. Г. Абдулаев). [c.609]

Чтобы расшифровать правила узнавания и связывания, используемые в морфогенезе сложных тканей, идеальной была бы возможность инактивировать различные типы белков-рецепторов межклеточной адгезии и адгезии между клетками и матриксом индивидуально и в различных комбинациях. По мере того как возрастает число охарактеризованных моноклональных антител и белковых фрагментов, каждый из которых блокирует один-единственный тип молекулы межклеточной адгезии или рецептора матрикса, и по мере того как гены, кодирующие эти белки клеточной поверхности, становятся доступными для использования in vitro и в трансгенных животных, эта мечта биологов развития становится реальностью. [c.525]

Наличие разных моноклональных антител к одному и тому же продукту лежит в основе количественного иммунологического анализа белка методом сэндвича , когда одно антитело используется в качестве твердой фазы для связывания присутствующего в растворе антигена, а другое антитело используется в качестве меченого зонда для обнаружения иммобилизованного материала. Хотя мы работали как с зондами, меченными так и с зондами, меченными ферментативно активными конъюгатами (в последнем случае обычно к антителам присоединяли биотин и использовали конъюгат фермента с авиди-ном), здесь мы приводим описание только первой методики, поскольку в нашей практике она оказалась более удобной. Этот метод пригоден также и для выяснения следующего вопроса о том, конкурируют ли между собой антитела за взаимодействие со стерически тесно ассоциированными участками, а также для изучения белок-белковых взаимодействий. [c.197]

Для того чтобы максимально эффективно использовать моноклональные антитела в функциональном анализе, необходимую, чтобы сайты связывания были картированы как можно точнее. Довольно простой подход к решению этой проблемы состоит в блот-гибридизации колоний с серией перекрывающихся гибридных белков, что позволяет идентифицировать искомые последовательности, состоящие примерно из 50 аминокислот. Методика блот-гибридизацки колоний приводится в табл. 6.1. Следующий шаг — это синтез перекрывающихся пептидных последовательностей для идентификации участка с точностью до нескольких аминокислот. Мы успешно использовали этот подход при картировании РАЬ204, ингибирующего АТРазу [6], [c.200]

Рис. 6.8. Специфическая локализация гибридных белков САТ-8У-40 после трансфекции клеток МШЗТЗ рекомбинантными конструкциями на основе челночных векторов. А. Реакция гибридного белка САТ-фрагмент большого Т-антигена (аминокислоты —271) с моноклональными антителами, узнающими К-концевой участок Т-антигена, демонстрирует, что гибридный белок локализуется в ядре. Б. Реакция гибридного белка САТ-фрагмент малого 1-антигена (аминокислоты 1—174) с моноклональными антителами, узнающими уникальный участок последовательности 1-антиге-на, демонстрирует, что гибридный белок локализуется в цитоплазме. Для выявления связывания антител с гибридными белками использовалась пероксидазная система иммунодетекции (как описано в табл. 6.7).

Для насыщения поверхности одной лунки поливинилхлоридной панели достаточно 20 нг чистого гликолипидного или около 100 нг фосфолнпидного антигена. Опыты с мечеными липидами показывают, что после серии инкубаций и отмывок с твердой фазой остается связанной только небольшая доля вносимого исходно в лунки липидного материала. Липиды, по-видимому, сорбируются на поверхности полимера за счет гидрофобных взаимодействий, так как их связывание весьма чувствительно к действию неионных детергентов, которые практически не влияют на связывание белков с поливинилхлоридом. Вследствие этого к антителам или отмывочным растворам нельзя добавлять детергенты, что обычно делают для снижения фона. Хотя для большинства моноклональных антител характерен низкий фон в системах без детергентов, около 5% моноклональных антител (по данным анализа большого числа клонов) неспецифически связываются с поверхностью поливиниловых панелей. Эти прилипшие антитела могут давать ложноположительные реакции. Проблему фона пытаются решить с помощью свободного от липидов бычьего сывороточного альбумина (БСА), однако лучше всего ставить контроль на неспецифическое связывание в лунках без липидного антигена. [c.163]

Лизис нагруженных белком А эритроцитов можно использовать при анализе у Xenopus клеток, образующих иммуноглобулины, по описанным в литературе методикам. Для такого анализа, так же как и для обратного локального гемолиза, необходимо определение оптимальных разведений (титрованием) кроличьих антител против иммуноглобулинов Xenopus. Например, нашу антисыворотку для использования в тесте с нагруженными белком А эритроцитами нужно разводить 1 80, а для обратного гемолиза 1 256. Вероятно, антисыворотка обеспечивает более прочное связывание антител низкой аффинности с клетками-мишенями. Ни одни из известных моноклональных антител против IgY не дают присущего кроличьим антисывороткам усиливающего эффекта. [c.503]

Антитела, играющие важную роль в подавлении вирусных инфекций, используют для выявления иммунитета к вирусам. Согласно полученным in vitro достоверным доказательствам, антитела классов IgG и IgM эффективно нейтрализуют вирус в жидкой фазе [11, 12, 35]. Это может быть результатом предотвращения связывания вируса со. специфическими клеточными рецепторами или результатом агрегации вирусных частиц, вызванной антителами. Соединение вирусов с IgG-антителами способствует фагоцитозу мононуклеарными клетками и полиморфноядерными лейкоцитами, осуществляемому с помощью имеющихся на этих клетках F -рецепторов. Однако этот последний процесс может усиливать репликацию некоторых вирусов (см. выше). Дальнейшее понимание процессов, необходимых для нейтрализации, может прийти в результате исследований с моноклональными антителами. Например, моноклональные антитела к белку Е1 вируса Синдбис, которые in vitro не нейтрализуют вирус, тем не менее обеспечивают защиту при введении in vivo. Показано, что эти антитела распознают вирус-специфические участки на зараженных клетках, но не распознают их на вирионах и что для эффекта защиты необходима активация антителами комплемента [43]. [c.25]

Идентификация антигенных детерминант на поверхности вириона важна для изучения механизма нейтрализации. Она служит фундаментом для понимания молекулярных основ се-ротипирования, а также для создания субъединичных вакцин. Исследование мутантов, устойчивых к нейтрализации моноклональными антителами, показывает, что в случае полиовируса типа 3 основной антигенный участок находится в районе аминокислотных остатков 93—100 [215, 283]. Связывание нейтрализующих моноклональных антител с синтетическими пептидами, отвечающими областям, специфичным для полиовируса типа 1 [303], свидетельствует о том, что участок связывания находится в районе аминокислотных остатков 93—100 в молекуле белка VP1, и указывает на наличие дополнительных участков связывания в положениях 11 — 17 и 70—75 VP1, в положении 162—173 VP2 и в положении 71—82 VP3 [91]. [c.209]

Результаты исследований in vivo и in vitro, описанные выше, ясно указывают на важнейшую роль сегмента S1 и белка al в связывании и проникновении реовируса в клетку. Получение моноклональных антител к этому белку [48] позволило определить функции отдельных доменов или эпитопов al. Выращивая реовирус типа 3 в присутствии моноклональных антител против главного нейтрализующего участка al, можно получить клоны вируса, устойчивые к нейтрализации. Несколько таких вариантов охарактеризовано. Варианты А, F и К оказались существенно менее вирулентны, чем исходный штамм (табл. 20.12) [292— [c.302]

Исследование изолированных полипептидных цепей иммуноглобулинов и реконструированных из них молекул указывает на то, что большинство идиотипических детерминант образовано при участии как легкой, так и тяжелой цепи. В частности, установлено, что изолированные легкие цепи миеломного иммуноглобулина не реагируют с антителами, полученными против идиотипических детерминант целой молекулы белка. При реконструкции молекулы из изолированных цепей структура идиотипических детерминант восстанавливалась только в том случае, если легкие и тяжелые цепи принадлежали иммуноглобулину, который служил антигеном при получении антиидиотипической сыворотки. Последнее не удивительно в свете уже обсуждавшейся в разделе 3.3 работы К. Доррингтона, в которой было показано, что при реконструкции молекулы иммуноглобулина из легких и тяжелых цепей, взятых из разных молекул (разных моноклональных иммуноглобулинов), связывание легкой цепи идет за счет ее константного домена, а вариабельные домены легкой и тяжелой цепей не взаимодействуют между собой. [c.89]

Число разных активных центров (центров связывания), образуемых лимфоцитами в форме антител, по примерным оценкам, составляет 10 это значительно больше (примерно на два порядка), чем число разных центров связывания, образуемых в форме всех других белков всеми другими клетками, вместе взятыми. Разнообразию антител соответствует разнообразие В-лимфоцитов. Как показали опыты по культивированию лимфоцитов in vitro, колония клеток, выращенных из одной клетки (моноклональная культура), синтезирует антитела одного типа. Моноклональные колонии, выращенные из разных клеток лимфоцитов, синтезируют разные антитела. Следовательно, популяция лимфоцитов в организме гете-рогенна существует клонов лимфоцитов, каждый из которых синтезирует антитела только одного типа. Общее число лимфоцитов в теле человека составляет 10 следовательно, они образуют 10 клонов по 10 клеток в каждом клоне (все приведенные величины являются приближенными). [c.478]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология