Иммуноадсорбенты

Некоторые производные полисахаридов находят применение в промышленности так, например, ксантогенат целлюлозы применяется для производства искусственного шелка, а нитрат целлюлозы— для производства взрывчатых веществ. В связи с появлением водонерастворимых реагентов для приготовления иммуноадсорбентов и перевода ферментов и антител в нерастворимое состояние был синтезирован ряд новых модифицированных полисахаридов. Сведения о таких производных включены во многие обзоры, посвященные полисахаридам, например целлюлозе [222,223], крахмалу [224, 225] и другим [226] см, также [65, 227]. Чтобы облегчить поиск ссылок на методы их получения, эти производные классифицированы ниже по типу содержащихся в их молекулах заместителей, а не по природе исходного полисахарида. [c.273]

Иммуноадсорбция. Абсолютно специфическим адсорбентом для любого фермента или белка является антитело к этому белку, которое связано с нерастворимой матрицей. Антитела обладают высокой избирательностью только к тем белкам, против которых они были получены. Поэтому при использовании иммуноадсорбентов можно получить препараты фермента более чистые, чем при использовании на других типах аффинных адсорбентов. [c.56]

Им удалось ковалентно пришить мышиное моноклональное антитело против лейкоцитарного интерферона человека к твердому носителю — сефарозе. С помощью полученного таким образом специфического иммуноадсорбента удалось за один цикл очистить в 5000 раз лимфобластоидный интерферон. Важное преимущество этого способа заключается в том, что для. производства антител требуется очень немного частично очищенного антигена, поскольку разработаны методы отбора ш г о жрования искомого гибрида. [c.334]

Таким образом можно получить сотни или тысячи гомогенных иммуноглобулинов. Очистка их производится при помощи аффинной хроматографии. Иммуноадсорбенты для этой цели готовятся введением нужного сахарного остатка в молекулы подходящих носителей—сефа-розы, бромацетилцеллюлозы и др. [c.103]

Получение иммуноадсорбентов с очень низким неспецифическим связыванием с использованием окисленной перйодатом поперечно-сшитой сефарозы [c.67]

Ранее был описан активированный перйодатом сефадекс (0-50 или 0-75) [6]. После присоединения иммуноглобулина и восстановления шиффовых оснований полученные иммуноадсорбенты характеризовались очень низким неспецифическим связыванием, но гели оказались механически весьма неустойчивыми и быстро забивались. Кроме того, гели имели очень низкую емкость, потому что антитела исключались из внутреннего объеме шариков. Хотя агароза имеет больший размер пор, этот гель активируется периодатным окислением в незначительной степени, так как реакция протекает только по концам цепей полисахаридных молекул. Однако периодатным окислением может быть активирована поперечно-сшитая агароза. В результате побочной реакции, сопровождающей процесс поперечной сшивки с эпихлорогидрином, на геле образуются гликоли. Периодатное окисление этих гликолей приводит к альдегидам, которые могут реагировать с аминогруппами белка. Образовавшиеся шиффовы основания могут быть далее восстановлены, как описано для других матриц. Иммуносорбенты, полученные таким путем, характеризуются очень хорошими хроматографическими свойствами, сочетая жесткость агарозных шариков с химической стабильностью и низким неспецифическим связыванием. Могут быть достигнуты высокие скорости потока даже при использовании таких хаотропных агентов, как 6,0 М солянокислый гуанидин [7]. [c.68]

Электрофоретическая десорбция была разработана для мягкого удаления заряженного вещества с аффинных матриц, в особенности с иммуноадсорбентов, без использования хаотропных реагентов [37, 38]. Метод дает прекрасные выходы и применим во всех случаях, когда имеет место обратимое равновесие при взаимодействии компонентов аффинной системы. Он ис- [c.119]

Таблица 4. Некоторые элюенты, используемые для десорбции с иммуноадсорбентов [20]. (Воспроизведено с разрешения.)

Получение иммуноадсорбентов. Общая методика [c.154]

Иммуноадсорбент может быть получен иммобилизацией полученного по вышеописанной методике препарата антител на NBr-активированной сефарозе [31]. [c.154]

Метод основан на расщеплении под действием бромелаина твердого остатка, полученного после центрифугирования при 100000тканевого гомогената полученный таким образом растворимый фермент далее очищают с помощью аффинной хроматографии на колонке со специфическим иммуноадсорбентом. [c.155]

К препарату солюбилизированной GGT добавляют хлорид, натрия (85 мг/10 мл), пропускают раствор через колонку с иммуноадсорбентом при комнатной температуре и собирают фракции (по 5 мл или 1 мл при скорости потока 40 или 10 мл/ч соответственно). [c.156]

Наносят 1000 ед. GGT почек крысы на 1 мл иммобилизованных антител против GGT почек крысы и 400 ед. GGT почек быка на 1 мл иммобилизованных антител против GGT почек быка. Фракции, содержащие GGT, не связавшуюся с иммуноадсорбентом, можно хроматографировать повторно. [c.156]

Повторная хроматография однократно очищенного препарата GGT. К препарату GGT, элюированному с иммуноадсорбентов, добавляют хлорид натрия (85 мг/10 мл) и вновь хроматографируют материал в условиях, описанных в разд. 4.5.2. Благодаря этой операции увеличивается удельная активность очищенной GGT, как показано для GGT почек быка и GGT почек мыши (табл. 2 и 7). [c.156]

Регенерация иммуноадсорбентов. Колонки с иммуноадсорбентами после элюирования GGT могут быть регенерированы путем промывания 0,2 М глицин-НСЬбуфером (pH 2,2 10 объ- [c.156]

Гомогенат Суспензия остатка после центрифугирования при 100 000 g После солюбилизации с бромелаином Элюат с иммуноадсорбента Элюат после повторной хроматографии [c.157]

GGT из почек быка. Легкая форма GGT из почек быка может быть очищена по общей методике, описанной в разд. 4.5. Более высокая удельная активность достигается после повторной хроматографии фермента, элюированного с колонки с иммуноадсорбентом (иммобилизованные антитела против GGT почек быка). Продукт показывает 2500-i-3500-кратное увеличение GGT-активности по сравнению с гомогенатом. Выход очищенного фермента достигает 46%. Данные по очистке суммированы табл. 2, а кривая элюирования с колонки с иммуноадсорбентом приведена на рис. 9. [c.157]

Жидкую фазу отделяют и очищают на одной колонке с иммуноадсорбентом (иммобилизованные антитела против легкой формы GGT из почек быка). [c.157]

GGT из коровьего молока. Для очистки легкой формы GGT можно использовать иммуноадсорбент (иммобилизованные ан-титела против GGT из почек быка). [c.159]

Солюбилизированная GGT молока может быть далее очищена на иммуноадсорбенте, как подробно описано в разд. 4.5. Фермент, элюированный водой, показывает активность в 13000 раз большую, чем в молоке со снятыми сливками. Суммарный выход очищенного препарата 15%. Данные по очистке приведены в табл. 5. [c.159]

GGT из почек мыши. Чувствительный электрофоретический метод разделения смеси GGT-антител позволяет продемонстрировать сильное иммуновзаимодействие между GGT из почек мыши и антителами против GGT из почек крысы. Это подтверждает возможность использования иммобилизованных антител против GGT из почек крысы в качестве иммуноадсорбента для очистки GGT из почек мыши. Данные по очистке фермента из почек мыши суммированы в табл. 7. Подробная методика во многом аналогична описанной выше общей методике. После повторной хроматографии активность GGT увеличивается в 530 раз при суммарном выходе 35%. [c.160]

При анализе методом двойной иммунодиффузии препарат GGT, очищенный из почек быка с применением иммуноаффинной хроматографии, дает с гомологичными антителами три отдельные дуги преципитации, каждая из которых проявляет GGT-активность. Ферментный препарат может быть также разделен на четыре активные фракции изоэлектрическим фокусированием. GGT из почек крысы, очищенная на иммуноадсорбенте, дает с гомологичными антителами две дуги преципитации, обладающие ферментативной активностью. Эти наблюдения подтверждают предположение, что GGT присутствует в виде нескольких молекулярных форм, которые могут отличаться по содержанию сиаловой кислоты. Тэйт и Мейстер [34] впервые продемонстрировали, что чистая легкая форма GGT из почек крысы может быть разделена на несколько ферментных форм. Эти наблюдения делают очевидным тот факт, что молекулярные формы, очищенные на иммуноадсорбентах, иммунологически неразличимы. [c.162]

Второй метод заключается в применении. высокой концентрации соли, вызывающей нарушение всех негидрофобных взаимодействий -между иммобилизованным лигандом и белком, в том числе любых биоспецифических ионных или других полярных сил. Повышение концентрации соли приводит к возрастанию гидрофобных сил, и один из недостатков данного способа состоит в том, что, при его использовании могут усилиться неспецифические взаимодействия. Тем не менее соль обычно вытесняет белок. Иногда происходит слишком сильное связывание и ни соль, ни свободный лиганд не способны вытеснить белок (этО в особенности относится к иммуноадсорбентам, см. разд. 4.7). В таких случаях могут быть полезны хаотропные соли, например тиоцианат при высоких концентрациях. Иногда для этого лучше использовать низкие значения pH (но не слишком низкие, чтобы не денатурировать белок). [c.162]

Ввиду того что существует много великолепных обзоров и монографий по аффинной хроматографии (см. в конце главы), я не останавливаюсь на этом вопросе более подробно и не перечисляю различные типы адсорбентов. Однако особый тип иммуноадсорбентов, в которых лигандом служит антитело к выделяемому белку, разбирается отдельно в разд. 4.7. [c.163]

Абсолютно специфическим адсорбентом для любого фермента или белка является антитело к этому белку, связанное с нерастворимой матрицей. Антитела высокоспецифичны и имеют очень высокое сродство к тем белкам, против которых они получены. Следовательно, на колонке с соответствующим иммуноадсорбентом можно, как правило, осуществить гораздо более избирательную сорбцию, чем на аффинном адсорбенте любого другого типа иммуноадсорбенты, представляющие собой специализированные биоспецифические адсорбенты, описаны в разд. 4.5. [c.173]

Иммуноадсорбент + Связанный фермент (антиген) [c.176]

Риа 4.49. Удаление антигена с иммуноадсорбента с помощью хаотропной соли и быстрое отделение соли от антигена (очищаемого белка). [c.176]

Большинство проблем, возникающих при использовании по-ликлональных антител, может быть решено с помощью новой технологии получения моноклональных антител [106]. Применяемые при этом оборудование и методы достаточно просты, но к ним предъявляются более высокие требования, чем при производстве обычных антител. Моноклональные антитела по-сравнению с поликлональными имеют следующие преимущества при получении иммуноадсорбентов [c.177]

Поскольку моноклональные антитела —это чистый препарат антител, все молекулы связанного на адсорбенте иммуноглобулина специфичны по отношению к нужному ферменту. Таким образом, емкость иммуноадсорбента обычно уве-личивается по меньшей мере в 10 раз. [c.177]

Поскольку иммуноадсорбенты (поликлональные и моноклональные) обладают высоким сродством к выделяемому ферменту, их удобно использовать для адсорбции в объеме (см. разд. 4.9).. Однако образование комплекса между антигеном и антителом — обычно медленный процесс следовательно, сорбируя фермент в объеме или на колонке, необходимо, чтобы было достаточно времени для завершения адсорбции. Важно также, чтобы в ходе элюции скорость потока была очень низкой может оказаться полезным даже совсем прекратить про-лускание элюента [104]. [c.178]

Аффинные адсорбенты значительно более селективны, но, как указывалось в разд. 4.6, без заметных неспецифических взаимодействий едва ли можно добиться, чтобы значения Кр были меньше 10" М. Если аффинный сорбент содержит лиганд, очень прочно связывающийся с ферментом, и неспецифические взаимодействия малы (благодаря использованию гидрофильных мостиков или вследствие прямого присоединения лиганда к матрице), то адсорбция фермента на таком сорбенте в объеме может дать весьма хорошие результаты. Особенно пригодны для адсорбции в объеме иммуноадсорбенты, поскольку они избирательно и прочно связывают антиген. Адсорбенты, модифицированные красителями, также удовлетворяют этим условиям, однако они сравнительно менее специфичны. Б данном случае может понадобиться весьма большое количество адсорбента, чтобы адсорбировать весь желаемый фермент. Так, 907о глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (из дрожжей и бактерий) можно адсорбировать из сырого экстракта на сефарозе ЗВ, модифицированной проционовым красным НЕ, при соотношении а/1 5 = 0,1. Как видно из табл. 4.10, величина а равна в этом случае 0,99 или больше. [c.192]

К типичным материалам, используемым для адсорбции белков в объеме>, относятся гель фосфата кальцйя, ионообменники (особенно фосфоцеллюлоза), аффинные адсорбенты, адсорбенты, модифицированные красителями, гидрофобные адсорбенты и иммуноадсорбенты. [c.196]

Иммуноадсорбенты Контактное время составляет не- [c.265]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология