Аминогруппы концевые, определение в белках

Реакция с азотистой кислотой. Дезаминирование белков азотистой кислотой (метод Ван-Слайка) является одним из наиболее удобных приемов определения количества свободных аминогрупп в белках или степени замещения этих групп в их модифицированных производных. Дезаминирование белков проводят в 0,5 М ацетатном буфере (pH 4) при температуре 0° раствором 1 М азотистокислого натрия в течение различных промежутков времени. В этих условиях легче всего реагируют концевые -аминогруппы белка, значительно медленнее — е-аминогруппы и совсем медленно — гуанидиновые группы. [c.71]

ФТОР-2,4-ДИНИТРОБЕНЗОЛ, Im 27 С, i 137 °С/2 мм рт. ст. раств. в аф., бензоле, ацетонитриле, не раств. в воде. Реагент для идентификации оксисоединений и концевых аминогрупп в белках и пептидах по т-рам плавления продуктов взаимодействия фотометрич. определения тиолов. аминов и фенолов с помощью р-ции Яновского и в УФ области (для производных тиолов Хмакс 480—570, производных аминов 450—580, производных фенолов 560—580), [c.638]

Блестящее исследование строения инсулина, который относят или к низкомолекулярным белкам, или к большим природным полипептидам, позволило Зангеру и его сотрудникам определить полную последовательность аминокислотных остатков в его молекуле. Вещество это имеет тенденцию образовывать агрегаты. Определения эффективного молекулярного веса дают значения до 50 ООО. Однако были отделены и единицы с молекулярным весом (ЮОО. Концевые аминогруппы были помечены обработкой 2,4-динитро-фторбензолом, и белок был подвергнут частичному и полному гидролизу. Динитрофенильные группы (ДНФ) не удаляются кислым гидролизом. [c.591]

ПодготоЕ ленная путем модифицирования реакцией с -амино-пропилтриэтоксисиланом поверхность достаточно крупнопористого силохрома или силикагеля может быть использована для иммобилизации белков и, в частности, ферментов, нужных для проведения -биокаталитических реакций. Для этого, как указывалось в лек-дии 5, надо провести дальнейшее модифицирование поверхности адсорбента-носителя прививкой агента (глутарового альдегида), способного вступить в реакцию с аминогруппами как модификатора, так и балка. Адсорбент-носитель с привитыми теперь уже альдегидными концевыми группами вводится в реакцию с различными белками. Ра ссмотрим иммобилизацию уреазы — важного фермента, находящего также применение в аналитическом определении мочевины и в аппарате искусственная почка . На рис. 18.9 представлена зависимость активности иммобилизованной уреазы от количества иммобилизованного белка. Адсорбентом-носителем является макропористый силохром со средним диаметром пор 180 нм. Этот размер пор значительно превышает размер глобулы уреазы. Вместе с тем удельная поверхность этого силохрома еще достаточно высока (5 = 41 м /г), чтобы обеспечить иммобилизацию значительного количества уреазы. Из рис. 18.9 видно, что при этом удается иммобилизовать до 120 мг белка на 1 г сухого адсорбента-носителя (это составляет около 3 мг/м ). Активность уреазы снижается не более, чем наполовину, даже при большом количестве уреазы в силикагеле, зато иммобилизованный так фермент можно многократно применять в проточных системах, и он не теряет активности при хранении по крайней мере в течение полугода. [c.341]

Аналогичные превращения протекают в реакциях свободных аминогрупп концевых аминокислот в пептидах и белках, например, с 2,4-динитрофторбензолом при гидролизе пептидных связей 8] образующиеся динитрофениловые кислоты можно идентифицировать. О методах определения концевых групп см. раздел 2.3.2.2. [c.239]

Определение концевой аминокислоты белков. Метод, предложенный Эдманом [2], состоит в избирательном отщеплении Ы-конце-Бой аминогруппы. Реакция аминогруппы с Ф. (а) дает фенилтио- [c.44]

Если количество лизина в белке определить отдельно, то число концевых ос-аминогрупп может быть найдено путем вычитания соответствующего числа е-аминогрупп из общего числа аминогрупп, определенных по методу Ван-Слайка. Подобного рода определения, проведенные с лактоглобулином и инсулином [5], цитохромом с [6] и другими белками, показали, что в этих белках имеется значительный избыток й-аминогрупп. Данные, полученные таким косвенным методом, не являются, однако, совершенно точными, так как такие аминокислоты, как глицин или цистеин, при обработке азотистой кислотой по методу Ван-Слайка дают больше азота, чем это теоретически следует. [c.123]

Эта реакция оказалась очень важной для определения строения белков, так как реактив вступает в реакцию лишь со свободной аминогруппой концевой аминокислоты в белке, что позволяет идентифицировать концевую аминокислоту в его структуре. [c.317]

Концевые группы в молекулах белков обычно находятся в концевых аминокислотных звеньях полипептидных цепей. Концевая -аминокислота может быть связана с полипептидной цепью карбоксильной группой, а аминогруппа при этом остается свободной такие концевые аминокислоты называют -концевыми. Если концевая а-аминокислота связана с основной цепью аминогруппой, а карбоксильная группа свободна, то ее называют С-концевой аминокислотой. В соответствии с этим химия концевых групп большинства белков подразделяется на две большие области — реакции свободных аминных и карбоксильных групп. Реакции, характерные для этих групп, уже были рассмотрены в предыдущих разделах, посвященных реакциям функциональных групп боковых цепей. В настоящем разделе будут обсуждены реагенты и реакции, которые, как было найдено, наиболее применимы для определения концевых групп белков. [c.374]

Динитрофенильная группа связывается с аминогруппой аминокислоты очень прочно, поэтому эти производные не применяют при синтезе пептидов, но благодаря своей устойчивости они используются при определении концевых аминных групп в белках (см. стр. 510), [c.465]

Полипептидные цепи состоят из аминокислот, соединенных между собой пептидными связями, т. е. связями между а-ами-ногруппами и а-карбоксильными группами. Существуют открытые, циклические й разветвленные полипептидные цепи. Как правило, открытые полипептидные цепи имеют на од ном. конце свободную а-аминогруппу, а на другом свободную а-карбоксильную группу, которые могут быть обнаружены различными методами определения концевых групп [114, 277, 320]. В разветвленной полипептидной цепи одна из групп в зависимости от характера разветвления может отсутствовать. Большая часть белков представляет собой соединения с открытой цепью [265, 277]. [c.167]

Ранее для определения М-концевой аминокислоты широко использовали 2,4-динитрофторбензол. Незащищенные аминогруппы на концах цепей дают 2,4-динитрофенильные производные, по которым после кислотного гидролиза белка легко установить, какие именно аминокислоты были концевыми. [c.509]

Реакция дезаминирования азотистой кислотой лежит в основе общеизвестного метода определения аминогрупп по Ван-Сляйку он описан выше. Если соответствующим образом учитывать ограничения этого стандартного метода и тщательно контролировать условия реакции, то он окажется наиболее удобным способом определения количества свободных аминогрупп в белках. Легче всего реагируют концевые, а-аминогруппы, несколько медленнее—е. -аминогруппы и уже весьма постепенно выделяют азот гуанидинные группы. Тот факт, что количество свободных аминогрупп, определенных по методу Ван-Сляйка, превосходит содержание лизина, рассчитанное на основании аналитических данных, является первым доказательством наличия М-концевых групп в белках. Реакция с азотистой кислотой протекает быстро и количественно она нашла широкое применение для определения степени замещения аминогрупп в модифицированных белках. В последнее время предпочтение стали отдавать нингидринному методу. [c.313]

Первичная структура белков устанавливается методами химической деструкции. Очень важную роль в определении первичной структуры белков сыграл метод определения концевых групп. Он состоит в обработке белка 2,4-динитрофторбензолом. Незащищенные аминогруппы на концах цепи дают 2,4-динитрофенильные производные, по которым после кислотного гидролиза белка легко установить, какие именно аминокислоты были концевыми [c.359]

Электрометрическое титрование белков не может быть использовано для определения числа концевых аминогрупп, так как при таком титровании нет заметного перелома кривой в той точке, где кончается титрование аминогрупп и начинается нейтрализация имидазольных групп гистидина [7]. Тщательно проведенное электрометрическое титрование яичного альбумина и лактоглобулина показало избыток лишь в 1—2 свободных аминогрупп, если принять во внимание Е-аминогруппы лизина [8]. [c.123]

Наряду с перечисленными методами применяют приемы и методы анализа, принятые в химии белка, например определение концевых аминогрупп и др. Полное доказательство гомогенности исследуемых веществ может дать только сочетание нескольких различных методов. [c.75]

Одни из первых методов определения N-концевых аминокислотных остатков был предложен Ф. Сенгером в 1945 г. При реакции а-аминогруппы пептида или белка с 2, 4-динитрофторбензолом получается динитрофенильное (ДНФ) производное, окрашенное в желтый цвет. Последующий кислотный гидролиз (5,7 н. H l) приводит к разрыву пептидных связей и образованию ДНФ-производ-ного N-кониевой аминокислоты. ДНФ-Аминокислота экстрагируется эфиром и идентифицируется методом тонкослойной хроматографии в присутствии стандартов. [c.37]

Обсудим последовательные стадии определения первичной структуры небольшого пептида для белка эта процедура аналогична, но более громоздка. Сначала необходимо выяснить, какие аминокислоты находятся на концах цепи. Обратите внимание, что на рис. 40.1 одна концевая аминокислота содержит свободную а-аминогруппу, а другая концевая аминокислота — свободную а-карбоксильную группу. Эти аминокислотные остатки называют соответственно М-концевым и С-концевым. В соответствии с методикой, разработанной Сенджером в его работе с инсулином, сначала используется 1-фтор-2,4-динитробензол, который образует стабильное динитрофенильное производное с Ы-концевым остатком. После кислотного гидролиза модифицированная аминокислота отделяется и идентифицируется. Определение С-концевого остатка можно провести с помощью осторожной обработки ферментом карбоксипептидазой, которая специфически катализирует гидролиз С-концевой пептидной связи, отщепляя от полипептидной цепи единственную аминокислоту. Существуют также и другие методы определения Н- и С-конце-вых аминокислотных остатков, но два описанных являются наиболее распространенными. [c.374]

Определение аминогрупп. Концевые аминогруппы содержат белки и синтетические полимеры полипептиды, полиамиды, по-лигидразиды, полиуретаны, полимочевины, политриазолы и др. Аминогруппы в этих полимерах можно определять титрованием кислотами или ацетилированием. Метод титрования получил более хнирокое распространение, так как не все высокомолекулярные соединения, содержащие аминогруппы на концах цепи, могут быть ацетилированы из-за их плохой растворимости в пиридине или других применяемых для этой цели растворителях. С другой стороны, определению аминогруппы методом ацетилирования мешает наличие гидроксильных групп в полимерах. Для такого широкого круга полимеров с концевыми аминогруппами, естественно, трудно подобрать универсальную методику количественного анализа, поэтому остановимся лишь на примерах определения аминогрупп в полиамидах. [c.116]

Белки с большим молекулярным весом обычно состоят из нескольких полипептидных цепей. Каждая цепь в общем случае имеет одну свободную а-аминогруппу на N-терминальном конце и одну а-карбоксильную группу на С-терминальном конце. Однако некоторые белки являются исключением из этого правила— их а-аминогруппа находится в замаскированном состоянии, будучи замещена ацетильным или другим радикалом. Так, например, в белке вируса табачной мозаики (ВТМ) N-концевой участок полипептида представлен остатком N-ацетилсерин-тирозин. В этом случае для определения a-NHa-rpynn следует провести предварительно реакцию деацетилирования. Число а-аминогрупп в молекуле белка, так же как и число а-карбоксильных rpyrai указывает непосредственно на количество полипептидных цепей, присутствующих в молекуле данного белка. Таким образом, число полипептидных цепей может быть установлено путем определения числа N-концевых или С-концевых групп. [c.78]

Разработана методика, где метод изотошюго разбавления используется в сочетании с деградацией по Эдману [15], Со-1 ласно одному из вариантов этого метода, проводят одну сталию деградации но Эдману, в ходе которой блокируются е-аминогруппы остатков лизина, а затем конденсируют второй Ы-кои-невой остаток с реагентом, содержащим радиоактивную метку [94]. В этом случае нет необходимости экстрагировать производное Ы-концевой аминокислоты. Для количественного определения белка в образце используют аминокислотный анализ, а в аликвотных пробах гидролизата определяют радиоактивность. Для определения удельной радиоактивности [ С]ФИТЦ образец очищенного пептида модифицируют аналогичным образом. [c.35]

Предшественники (зимогены) — пепсиноген, трипсиноген и химо-трипсиноген получены в чистом виде. Активация заключается в удалении небольшого пептидного фрагмента и катализируется либо активной формой самого фермента, либо энтерокиназой, другим ферментом, имеющимся в пищеварительном тракте. При превращении трипсиноге-на в трипсин с N-конца белка отщепляются гексапептид вал— (асп)4 — лиз и N-концевой аминокислотой становится изолейцин (Нейрат , 1955). Активация других зимогенов более сложна. Ранние работы Бергмаина (1937) на простейших модельных пептидах показали, что ферменты избирательно расщепляют определенно пептидные связи. Пепсин, трипсин и химотрипсин известны как эндопептидазы, так как они расщепляют пептидные связи, расположенные внутри молекулы. Пепсин расщепляет амидные связи, образованные аминогруппами фенилаланина или тирозина химотрипсин расщепляет связи, образованные карбоксильными группами этих ароматических аминокислот. Трипсин расщепляет амидные связи, образованные карбоксильными группами основных аминокислот (лиз, арг). Эти протеолитические ферменты расщепляют также эфиры аналогичной структуры. Во всех случаях затрагиваются только пептиды, образованные -аминокислотами. Предположение Михаэлиса (1913), что реакции, катализируемые ферментами, проходят через стадию образования промежуточного фермент-субстратного комплекса, были подтверждены всеми последующими работами. С большой очевидностью показано, что каталитическая активность определяется небольшим участком фермента, так называемым его активным центром. [c.697]

Определение концевых групп.— Первым подходом к опреде лению последовательности аминокислот в белках и полнпеп тидах был метод Санжера (1945), предложенный для определения концевых аминогрупп. Реагентом для метки служит 2 -динитрофтор-бензол, полученный нитрованием фторбензола. Конденсация протекает в мягких условиях с образованием белка, блокированного остатком [c.690]

Как уже упоминалось, ПК в качестве лигандов могут обладать как групповой специфичностью (для белков хроматина, факторов управления трансляцией, нуклеаз и др.), так и индивидуальной (для индивидуальных мРНК, белков-регуляторов транскрипции и др.). Во втором случае на аффинном сорбенте должны быть закреплены вполне определенные участки генома. Это стало возмолшым после создания способов отбора и наработки в достаточных количествах строго идентичных фрагментов ДНК методами генной инженерии. В последнее время возникла еще одна область использования иммобилизованных НК — в качестве праймеров матричного синтеза. Эти приложения предъявляют разные требования к характеру фиксации НК на матрице. В первом случае расположение точек закрепления на молекуле НК может быть произвольным, во втором определенные и достаточно протяженные участки полинуклеотидной цепи должны быть свободны для комплементарного взаимодействия, а в третьем закрепление НК на матрице желательно осуществить лишь по одному определенному концу молекулы. Что же касается возможности реакций с активированными матрицами, то вдоль всей молекулы НК во множестве располагаются химически эквивалентные группы аминогруппы нуклеиновых оснований, гидроксилы сахаров и др. В особом положении находится только концевой остаток фосфорной кислоты или сахара. [c.387]

Ф. Сенгер разработал остроумный метод определения порядка чередования аминокислотных остатков в полипептидных цепочках инсулина. Действием на белок динитрофторбензола он динитрофенилировал аминогруппы аминокислот. Затем путем гидролитического расщепления белка ему удалось отделить Ы-концевую (содержащую свободную аминогруппу) динитрофе-ниламинокислоту и идентифицировать ее. Таким же путем он отделял следующие в полипептидной цепочке аминокислоты друг за другом и тем амым установил их порядок расположения. Оказалось, что одна из цепочек молекулы инсулина (Л) состоит [c.262]

В полипептидной цепи белка с одной стороны расположен аминокислотный остаток, несуший свободную а-аминогруппу (амино-или N-концевой остаток), а с другой—остаток со свободной а-карбоксильной группой (карбоксильный, или С-концевой остаток). Аналиэ концевых остатков играет важную роль в процессе определения аминокислотной последовательности белка. На первом этапе исследования он дает возможность оценить число полипептидных цепей, составляющих молекулу белка, и степень гомогенности исследуемого препарата. На последующих этапах с помощью анализа N-концевых аминокислотных оста ков осуществляется контроль за процессом разделения пептидных фрагментов. [c.37]

Относительную чувствительность аминокислотных остатков в инсулине к "[-излучению исследовали Дрейк и его сотрудники [69]. Как указывалось ранее, интенсивное исследование инсулина особенно желательно, поскольку он является единственным белком, строение которого полностью известно. На основании результатов определений концевых групп, изучения спектров поглощения и хроматографии аминокислот на бумаге в образцах, подвергнутых облучению дозами до 40 мегафэр, были сделаны выводы 1) что цистин, тирозин, фенилаланин, пролин и гистидин обладают высокой радиочувствительностью 2) что лейцин, изолейцин, валин, лизин и аргинин заметно разрушаются при наиболее высоких дозах и 3) глицин и фенилаланин, Н-концевые аминокислоты (т. е. имеющие свободные а-аминогруппы) дезаминируются. [c.227]

При этом анализу подвергают отщепляющуюся аминокислоту или непосредственно ее фенилтиогидантоин. Указанный принцип положен в основу работы секвенсоров, автоматически определяюш их аминокислотную последовательность в пептидных фрагментах, получаемых ферментативным расщеплением исследуемых белков. По Сэнджеру концевую аминогруппу П. маркируют 1-фтор-2,4-динитробензолом, подвергают П. гидролизу и определяют динитрофенильные производные аминокислот. С-Концевую аминокислоту можно отщепить с помощью карбоксипептидазы. Используют также полный гидразиполиз пептида. При этом все аминокислоты, кроме С-концевой, выделяются в виде гидразидов. Применяют также масс-спектрометрич. определение аминокислотной последовательности в П. Сведения об оптич. чистоте П. могут быть получены исследованием их атакуемости природными ферментами. [c.15]

Относительно легко удается установить, каким аминокислотам принадлежит свободная аминогруппа (Н-концевые аминокислоты) и каким — свободная карбоксильная группа (С-концевые аминокислоты). К-концевая аминокислота в белке, взаимодействуя при определенных условиях с динитрофторбензолом, дает довольно прочное соединение, которое не разрушается при гидролизе белка и выделяется в виде динитрофе-нилпроизводного этой аминокислоты, в то время как остальные аминокислоты выделяются при гидролизе в свободном виде (Сангер). Если при обработке динитрофторбензолом образуются динитрофеннлпроизводные нескольких аминокислот, то отсюда следует, что в данном белке имеется несколько различных полипептидных цепей, содержащих различные концевые аминокислоты. [c.40]

Существует четыре метода определения N-концевых аминокислот. Первый из них основан на арилировании полипептида 1-фтор-2,4-динитробензолом (уравнение III.3) с образованием 2,4-динитрофенильного производного N-концевого остатка. Полный гидролиз белка, экстракция ДНФ-аминокис-лоты органическими растворителями и хроматографирование или какое-нибудь другое определение модифицированной аминокислоты позволяют затем установить природу N-концевого остатка. Очевидно, что некоторые другие группы белка, например е-аминогрунпа лизина, также будут реагировать с 1-фтор-2,4-динитробензолом, однако из а-аминогрупп будет моди- [c.86]

Аналогичным образом протекает и рёакция аминогрупп аминокислот с арилизотиоцианатами. Эта реакция была использована Эдманом для определения концевых а-аминокислот в молекуле белка (см. гл. П1) в качестве арилизотиоцианата использовался фенилизотиоцианат [c.56]

Бензоильные производные белков можно получить при обработке растворов белков в разведенном углекислом натрии бен-зоилхлоридом СбНбСОС [15]. Ацильные группировки, вошедшие в белки, отщепляются в процесе кислотного или щелочного гидролиза, вследствие чего соответствующие производные белков не могут быть использованы для определения числа концевых аминогрупп. При воздействии 0-метилизомочевины аминогруппа лизина образует гуанидиновую группировку, в результате чего получаются гуанидизированные белки [c.124]

Свободные аминогруппы, которые содержатся только на М-кон-цах белковых цепей и в остатках лизина (е-аминогруппа), обнаруживают, добавляя к белку фенилизотиоцианат (ФТЦ-метод) или динитрофторбензол (ДНФБ-метод.) При добавлении к белку фенил-изотиоцианата образуются фенилтиогидантоиновое производное концевой аминокислоты и укороченный пептид с новой концевой аминогруппой. С помощью хроматографии на бумаге идентифицируют фенилтиогидантоиновое производное, а оставшийся пептид снова обрабатывают фенилизотиоцианатом. Таким образом можно определить последовательность до десяти аминокислот дальнейшее определение аминокислот затрудняется увеличением количества побочных продуктов. [c.289]