Нитроцеллюлоза при гибридизации

Процедура ДНК-гибридизации состоит в следующем. ДНК-мишень подвергают денатурации и одноцепочечные молекулы необратимо пришивают к твердой подложке (нитроцеллюлоз-ному или найлоновому фильтру). Эту процедуру обычно проводят при высокой температуре. Затем фильтр инкубируют с одноцепочечным ДНК-зондом, меченным радиоизотопом или другой меткой. Если нуклеотидные последовательности зонда и ДНК-мишени комплементарны, то происходит их спаривание (т. е. гибридизация) (рис. 4.11). Гибридные молекулы можно [c.65]

Буфер поднимается по фильтровальной бумаге, перенося фрагменты ДНК. ДНК химически связывается с нитроцеллюлозой при выдерживании при температуре 80° С в течение двух часов. После этого нитроцеллюлозный фильтр готов к гибридизации с радиоактивным зондом [c.285]

После гибридизации в течение по крайней мере 24 ч выньте полоску нитроцеллюлозы, на которую был перенесен материал из геля, из мешочка, в котором проводилась гибридизация. Промойте ее, промокните досуха, оберните в пластиковую пленку и экспонируйте с рентгеновской пленкой. [c.51]

Этапы 7—10) это обычные процедуры, выполняемые при работе с нитроцеллюлозой. Точное выполнение этих операций не является критическим. Даже при опускании этапов 7—9 слабые сигналы гибридизации все еще будут наблюдаться. Не проводите отжига фильтров в течение более 2 ч и не нагревайте их выше 80°С. В противном случае фильтры станут еще более ломкими, чем обычно. [c.119]

Гель, окрашенный бромидом этидия, необходимо защищать от воздействия света. Для хранения, окраски, отмывки и гибридизации используются специальные закрывающиеся контейнеры. Для переноса ДНК мы применяли нитроцеллюлозные фильтры чаще, чем найлоновые, хотя в последнем случае отношение сигнал/фон оказывается ниже. При использовании нитроцеллюлоз-ных фильтров в частичном гидролизате ДНК млекопитающих с помощью уникального зонда при двухдневной экспозиции обычно удается выявить 4—6 полос. Наибольшее количество фрагментов, которые мы были в состоянии выявить с таким зондом,— [c.79]

Данный метод включает иммобилизацию вирусной нуклеиновой кислоты на нитроцеллюлозе и гибридизацию ее с комплементарной нуклеиновой кислотой в качестве зонда. Экстрагировать нуклеиновую кислоту из вирусных частиц перед нанесением на нитроцеллюлозу нет необходимости. Фракции сахарозных или цезиевых градиентов можно наносить непосредственно,, не удаляя среды, используемой для центрифугирования. [c.29]

Значительная доля ДНК вымывается из геля током жидкости, идущим от нижнего листа фильтровальной бумаги через гель и нитроцеллюлозный фильтр к верхним, первоначально сухим, слоям бумаги. На нитроцеллюлозе эта ДНК прочно сорбируется в тех местах, которые лежат непосредственно над полосами ДНК в геле. Высокая концентрация соли способствует сорбции. После этого с помощью известных методов гибридизации на нитроцеллюлозных фильтрах (их рассмотрение выходит за рамки этой книги) можно идентифицировать отдельные полосы ДНК в этой копии , а следовательно, и в самом геле. [c.162]

Другое назначение мембран из нитроцеллюлозы применительно к технологии рекомбинантных ДНК заключается в обнаружении молекул специфической ДНК в бактериальных колониях, выращиваемых в чашках с агаром (рис. 11.14). С помощью соответствующего раствора ДНК освобождается из бактериальных колоний или вирусных бляшек. Затем над колониями помещают листовую мембрану из нитроцеллюлозы, и некоторое количество свободной ДНК переносится на мембрану. При использовании в виде зондов радиоактивных РНК и ДНК точное расположение на мембране искомой ДНК определяется гибридизацией и последующей авторадиографией. Соответствующая колония на исходной чашке после этого переносится для дальнейшего изучения. [c.325]

В этой главе было описано использование мембранных фильтров в ряде отраслей биомедицины. Мы показали, что мембранные фильтры находят широкое применение в биомедицинских исследованиях как в своей обычной роли в качестве фильтрующих, так и в менее привычных ролях, а именно в качестве подложек при изучении белков и нуклеиновых кислот. Возможно, одна из наиболее широких областей применения мембранных фильтров связана с количественным определением радиоактивных веществ с помощью жидкостного сцинтилляционного счетчика, хотя в некоторых случаях, оказывается, лучше использовать стекловолоконные фильтры. Важным достижением в области молекулярной биологии стало применение мембран из нитроцеллюлозы для гибридизации нуклеиновых кислот. Без разработки методов гибридизации с помощью мембранных фильтров было бы значительно задержано развитие технологии рекомбинантных ДНК. [c.331]

Рис. 4-72. Методы Нозерн - и Саузерн -блоттинга. После электрофоретического фракционирования смеси молекул ДНК или РНК в агарозном геле проводят перенос различных фрагментов нуклеиновых кислот на лист нитроцеллюлозы или найлона ( блоттинг ). Этот лист затем инкубируют с радиоактивным ДНК-зондом в течение длительного времени в условиях, способствующих гибридизации. Затем лист тщательно промывают, гак что радиоактивно меченными оказываются лищь те фрагменты, которые гибридизуются с ДНК-зондом. На радиоавтографе,

В бляшке фага % содержится много фага и фаговой ДНК. Фаг и ДНК можно прямо из бляшек перенести на нитроцеллюлозу, если наложить на чашку сухой нитроцеллюлозный фильтр. После денатурации перенесенной на фильтр ДНК она оказывается уже готовой для гибридизации. Таким способом можно проверять до 25 ООО бляшек на одной чашке. Связанную с фильтрами денатурированную ДНК гибридизуют с ДНК, меченной Р с помощью ник-трансляции. После этого фильтр промывают и экспонируют с ним рентгеновскую пленку. Пятна почернения на пленке соответствуют гибридизующимся клонам. [c.46]

Выделяют ДНК из различных штаммов Salmonella. Выделяют ее прямо из колоний, используя методику быстрого выделения ДНК- Затем выделенную ДНК расщепляют разными рестрикционными эндонуклеазами, проводят электрофорез в агарозном геле и разделенные фрагменты переносят на нитроцеллюлозу. После этого проводят гибридизацию таких полосок нитроцеллюлозы с ДНК, меченной с помощью ник-трансляции. С этими полосками экспонируют рентгеновскую пленку. После того как пленка проявлена, мол<но определить размеры тех рестрикционных фрагментов, которые гомологичны использованной ДНК-зонду. [c.50]

Для контроля очень полезно на каждой стадии отбирать небольшие аликвоты (2—5% объема) и подвергать их электрофорезу в 1,4%-ном агарозном геле с последующим переносом на нитроцеллюлозу или полиамид и блот-гибридизацией с 8ирР-теяоы. В случае успешной реакции циклического лигирования ДНК гена зирР будет давать полосы в виде лестницы, и небольшое ее количество должно оказаться в той зоне геля, которая соответствует высокомолекулярной ДНК (что свидетельствовало бы о реакции лигирования с геномной ДНК). После обработки рестриктазой соН1 лесенка зирр-гена должна остаться, а полосы из высокомолекулярной области должны расщепиться на множество фрагментов размером от 1 до 20 т. п. н. [c.107]

После того как обработанная рестриктазами ДНК разделена путем электрофореза в агарозном геле, следующий эта заключается в переносе (блоттинге) разделенных фрагментов-ДНК на соответствующий фильтр. Впервые метод блоттинга-описан Саузерном [7]. Незначительно видоизменив сам метод многих лабораториях заменили нитроцеллюлозный фильтр, используемый в оригинальной методике, на более прочные-найлоновые фильтры. Кроме того, что они более прочные, эти-фильтры повышают чувствительность гибридизации и их можно использовать многократно, причем чувствительность пр этом не снижается (см. примечание ж в разд. 5.5.3). В любом случае ДНК необходимо вначале перенести с геля на подложку. Фрагменты ДНК большего размера обычно переносятся неочень эффективно, и в связи с этим ДНК частично апуринизи-руют, обрабатывая кислотой, чтобы раздробить молекулы-ДНК на фрагменты меньших размеров [9]. Затем ДНК в геле-денатурируют in situ, обрабатывая концентрированной щелочью, и перед переносом нейтрализуют, чтобы не повредить, фильтр. В результате этого процесса ДНК становится одноцепочечной. При использовании нитроцеллюлозных, но не найло-новых фильтров это абсолютно необходимо для закрепления ДНК и вне зависимости от типа подложки обеспечивает эффективность гибридизации. С появлением найлоновых подложек изменился и традиционный метод капиллярного переноса, разработанный Саузерном. Данный метод в настоящее время можно заменить электропереносом, который гораздо быстрее капиллярного (1—2 ч по сравнению с 12—16 ч), но приводит к некоторому снижению чувствительности [4]. После переноса ДНК должна быть зафиксирована на фильтре. В оригинальном методе Саузерна это осуществляется путем прогревания нитроцеллюлозного фильтра в течение нескольких часов-при 80°С. Для найлоновых мембран данная процедура заменена ультрафиолетовой сшивкой, что занимает несколько минут. Сшивка ультрафиолетом главным образом приводит к повышению чувствительности найлоновых фильтров, а также повышает-и чувствительность гибридизации на обычной нитроцеллюлозе-[4]. К сожалению, на практике эта стадия вызывает некоторые затруднения, поскольку неизвестно, какая доза ультрафиолетового облучения требуется для каждого из известных в настоящее время типов найлоновых фильтров. В связи с этим в- [c.287]

Этот вариант скрининга обусловлен низким выходом интересующего рекомбинантного клона. Высев колоний в этом случае можно производить до нескольких десятков тысяч на 90-мИ чашку (лучше не более 30 ООО). Вместо нитроцеллюлозы для переноса бактериальных клонов лучше использовать бумагу Whatman 542 (или 540, 541), так как в этом случае не требуется исключительных навыков по одергиванию колоний с агара и, в отличие от НЦФ, не возникает проблем с неполным или неравномерным отпечатыванием колоний на фильтре. Гибридизацию зовда с ДНК, иммобилизованной на бумажных фильтрах щюводят гак же, как и в случае с НЦФ (см. далее). [c.32]

Ннтроцеллюлрзные мембранные фильтры обладают способностью сорбировать щелочные белки. Этим можно воспользоваться для получения реплики . Фильтр накладывают на поверхность геля, и выходящие из него за счет диффузии белки тут же сорбируются и располагаются на нитроцеллюлозе точно такими же полосами, как и в геле. Далее уже на фильтре можно проводить идентификацию белков, например гибридизацией их с меченной Р ДНК [Bowen et al., 1980]. Простейшее устройство для этой цели, предложенное авторами цитируемой работы, [c.106]

Нитроцеллюлоза сорбирует только щелочные белки. Распространение этого метода на любые белки связано с использованием так называемой диазобумаги , на которой предварительно закреплены афинные сорбенты, например антитела или антигены [Erli h et al., 1979]. Диазобумага была разработана и нашла. себе применение главным образом для гибридизации нуклеиновых кислот [Alwine et al., 1977], поэтому здесь нет места для описания ее особенностей. Отметим только способ переноса белков из ПААГ на диазобумагу. После электрофореза белков в системе Лэммли ДДС-Na вымывают из геля 0,15 М. Na-фосфатным буфером (pH 7,4) с 0,15 М Na l и 0,5% Тритона Х-100 при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем гель кладут на стопку фильтровальной бумаги в кювету, заполненную тем же буфером, накрывают диазобумагой, а ее — несколькими слоями сухой фильтровальной бумаги. Всю пачку прижимают через стеклян- [c.108]

Идентификация фрагментов одноцепочечной ДНК на нитроцеллюлоз-ном фильтре происходит с помощью гибридизации цепей ДНК. Большинство природных ДНК встречается в виде двухцепочечных молекул, где азотистые основания двух цепей взаимодействуют по принципу комплементарно-сти с помощью водородных связей. Водородные связи в условиях щелочного гидролиза разрываются, и на фильтре фиксируются одноценочечные фраг- [c.69]

Для гибридизации ДНК/ДНК, когда как связанная, так и гибридизированная нуклеиновые кислоты является одноните-выми ДНК, необходимо предварительно обработать мембрану, чтобы блокировать центры неспецифического связывания ДНК на нитроцеллюлозе. С этой целью Денхардт [61] успешно использовал 0,02 %-ные растворы фикола, поливинилпирролидона и бычьего сывороточного альбумина. [c.320]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология