Сплайсинг сайты

Рис. 20.29. Продолжение) Б. В полилипкер вектора для улавливания экзонов встроен фрагмент ДНК человека, и эта конструкция введена в эукариотическую клетку (трансфекция). В данном случае экзон содержит функциональные акцепторный и донорный сайты сплайсинга. При процессинге первичного транскрипта удаляются интроны, фланкирующие экзон А, и он оказывается между экзонами 1 и 2. Длина ПЦР-продукта обратного транскрипта показывает, пойман ли искомый экзон между экзонами 1 и 2 и, следовательно, содержит ли его данная вставка.

В экспрессирующие векторы млекопитающих уже встроены гены самых разных белков и осуществлена их экспрессия в хозяйских клетках. Иногда выход продукта увеличивался, если между промотором и клонированным геном встраивали интрон. Механизм этого феномена неизвестен. Возможно, первичный транскрипт клонированного гена содержит скрытые сайты сплайсинга, по которым вырезается часть кодирующей области клонированного гена, а при наличии дополнительного интрона сплайсинг по ним происходит с меньщей вероятностью. [c.150]

Если в вектор встроить рестрикционный фрагмент, содержащий некий экзон А и фланкирующие его интроны, то после трансфекции процессированный транскрипт будет содержать три экзона экзон 1-экзон А-экзон 2. Длина ПЦР-продукта будет больше, чем в тех случаях, когда в векторе нет вставки, когда вставка содержит экзон без функциональных сайтов сплайсинга (донорного и акцепторного) или когда вставка вообще не содержит экзона. Если во вставке присутствует более одного экзона, каждый из которых имеет функциональные сайты сплайсинга, то процессированный транскрипт будет содержать все эти экзоны. [c.476]

Например, если экспрессируется класс А, то вырезаются все фрагменты ДНК, соответствующие классам М, D, G, Е, и образуется активный фрагмент ДНК, включающий в себя вариабельные гены, а также ген, кодирующий константную а-цепь. Если же клетка должна экспрессировать антитело, допустим, класса Е, то под влиянием Т-клеток и цитокинов происходит переключение классов. Перед каждым геном тяжелых цепей (кроме D-класса) имеется сайт переключения. При наличии сигнала от Т-клеток или цитокинов эти участки рекомбинируют друг с другом, а промежуточные гены (соответствующие цепям С , g и С ) вырезаются. Удаление промежуточных генов происходит следующим образом. При получении сигнала на переключение соответствующие участки рекомбинируют, при этом образуется петля цепи ДНК, которая вырезается эндонуклеазами. Сайты рекомбинации расположены в зонах интронов и в результате сплайсинга также удаляются. [c.488]

Обратите внимание на то, что две границы различаются по последовательности оснований, поэтому они однозначно определяют расположение концов интрона. Их обозначают, следуя слева направо вдоль интрона, как /левую и правую точки сплайсинга. Иногда эти участки называют соответственно донорным и акцепторным сайтами, но мы будем избегать такого определения, поскольку оно предполагает наличие механизма, существование которого не доказано. [c.256]

До сих пор мы предполагали, что удаление каждого интрона осуществляется на определенном Этапе сплайсинга. Но это не обязательно так. В случае гена [3-глобина мыши обнаруживается 158-предшественник, содержащий только большой интрон. Это, возможно, означает, что первым удаляется малый интрон. Но затем большой интрон удаляется, возможно, в два этапа, поскольку имеется промежуточный продукт, содержащий только часть этого интрона. Таким образом, пытаясь обнаружить сайты, по которым происходит сплайсинг, не следует забывать, что, хотя они и должны содержать границы экзон—интрон, другие сайты, расположенные между ними, также могут быть использованы в качестве промежуточных. [c.324]

Для точного выяснения молекулярных механизмов сплайсинга необходимо исследовать природу границ сплайсинга (границ экзон—интрон), последовательностей, непосредственно окружающих сайты разрезания и сшивания. Как уже отмечалось в гл. 20, границы сплайсинга называются соответственно их расположению в интроне. Левая граница (иногда называемая донорной) находится [c.324]

Стрелками обозначены связи, сплайсинг которых приводит к превращению предшественника в зрелую РНК, но, являются ли они действительно сайтами сплайсинга. [c.325]

Предположение о том, что канонические последовательности-этой сайты, узнаваемые при сплайсинге, было высказано лишь за неимением лучшего объяснения. Но важная роль этих последовательностей непосредственно подтверждается существованием некоторых точковых мутаций, затрагивающих канонические последовательности и влияющих на сплайсинг. Такие мутации были обнаружены в случае талассемий человека, при которых нарушается образование либо а-, либо (3-глобинов. (Имеется много причин возникновения талассемий некоторые из них рассматривались в гл. 21.) [c.327]

Последовательность, содержащая мутировавший сайт, практически идентична последовательности, содержащей границы сплайсинга мутация приводит к тому, что шесть из семи оснований оказываются гомологичными. (А различающееся основание занимает положение, в котором и в нормальных сайтах сплайсинга других Р-подобных генов глобина находятся разные нуклеотидные основания.) Обратите внимание на то, что последовательность, состоящая из семи нуклеотидов, захватывает и область справа от сайта сплайсинга, не входящую в состав участка универсальной последовательности правой границы экзон—интрон. [c.328]

Благодаря методам генной инженерии исследователи получили возможность использовать для изучения клеточных механизмов мутации человека. Например, известно, что группа наследственных заболеваний крови, объединяемых под названием талассемии, характеризуется резким падением уровня гемоглобина. Секвенирование ДНК 50 больных талассемией показало, что в большинстве случаев снижение уровня гемоглобина было вызвано нарушением в сплайсинге РНК. Единичные замены нуклеотидов, обнаруженные в ДНК, либо инактивировали сайт сплайсинга, либо приводили к возникновению нового такого сайта. Удивительно, но анализ мРНК этих же больных показал, что потеря сайта сплайсинга не ведет к его отменению оставшийся нормальным второй, участвующий в сплайсинге сайт, ищет поблизости подходящий участок и соединяется с ним. Нри этом может реализоваться несколько вариантов сплайсинга, т. е. мутантный ген способен детерминировать несколько измененных белков (рис. [c.159]

По-видимому, в образовании лассо участвует последовательность сайта ветвления РНК, окружающая участвующий в реакции аденозин и способная образовывать комплементарную структуру с 5 -концом интрона (рис. 104). Внутренняя часть интрона, в ряде случаев достаточно протяженная, может быть безболезненно удалена без нарушения сплайсинга. Вопрос о том, какова судьба и возможная роль выщепляемых интронов, остается не ясным. [c.177]

Стрвлкн - сайты сплайсинга треугольники - нуклеотиды, замены которых нарушают сплайсинг А. Б и В — участки РНК, обеспечивающие комплементарные взаимодействия и создание структуры, предрасположенной к сплайсингу [c.168]

Наиболее широко среди перечисленных подходов применяется SS P. Суть метода состоит в следующем. Как можно большее (по возможности все) число экзонов исследуемого гена по отдельности амплифицируют методом ПЦР, используя в качестве матрицы ДНК больных и здоровых индивидов. Каждая пара праймеров выбирается из последовательностей, фланкирующих экзон, или из его концевых участков. Кроме того, используя данные секвенирования, выбирают праймеры для амплификации 5 -области, предшествующей первому экзону гена, 3 -области, следующей за последним экзоном, и участков, содержащих сайты сплайсинга. [c.467]

Если мутация в интроне распознается системой процессинга РНК как аутентичный сайт сплайсинга, то в процессированную мРНК включается часть интрона (рис. 21.17, А). Это приводит к сдвигу рамки считывания и образованию укороченного белка. При этом количество нормального белка снижается, что может стать причиной заболевания. Разумно предположить, что если антисмысловой олигонуклеотид, комплементарный мутантному интрону, гибридизуется с ним, то ошибочный сплайсинг блокируется, что повысит вероятность сплайсинга в нормальном сайте. Это предположение проверили на р-глобиновом гене с мутацией во [c.509]

Рис. 21.17. Коррекция дефекта, приводящего к ошибочному сплайсингу, с помошью антисмыслового олигонуклеотида. А. Результат мутации, приводящей к ошибочному сплайсингу. Обозначения цифры - экзоны, А -первый интрон, Б - второй интрон, содержащий мутацию (красный кружок), разделяющую его на две части (Б1 и Б2). Штриховые линии охватывают сегменты РНК, вырезаемые при процессинге. Возможны два варианта сплайсинга вариант а приводит к образованию функциональной мРНК, вариант б - к образованию РНК, включающей часть второго интрона (Б2). Б. Антисмысловой олигонуклеотид (АС), связывающийся с мутантным сайтом сплайсинга, препятствует его распознаванию при процессинге, и в результате образуется только функциональная мРНК.

Важным функциональным типом ядерной РНК являются малые ядерные РНК (м-яРНК), содержащие от 90 до 300 нуклеотидов с уникальной нуклеотидной последовательностью, комплементарной последовательностью сайтов сплайсинга. Благодаря этому м-яРНК регулирует созревание (процессинг) г-яРНК в зрелые мРНК. [c.184]

В отличие от этого короткий РНК-транскрнпт, определяющий секретируемую форму, имеет только донорный сайт поэтаму сплайсинг в этам случае невозможен. [c.42]

Мутации в кластерах box 9 и box 2 также не комплементируют мутации в других кластерах. Следовательно, по такому генетическому критерию они неотличимы от мутаций, затрагивающих экзоны. Однако их биохимические свойства различны, на что указывает нарущение синтеза соответствующей нормальной мРНК. При анализе нуклеотидной последовательности ДНК обнаруживается, что оба этих кластера находятся в области 14. Мутации кластера box 9 затрагивают последовательность ДНК длиной 8 п.п., находящуюся на 350 п.н. правее границы с В4. Мутации кластера box 2 смещены к другому концу интрона и находятся на расстоянии 25 п. н. левее границы с В5. Обе группы мутаций препятствуют объединению участков В4 и В5 в результате удаления области 14 при сплайсинге. Существование этих мутаций указывает на два важных обстоятельства общего характера. Во-первых, мутации, затрагивающие специфические сайты, могут препятствовать узнаванию определенньрс границ сплайсинга, причем такие сайты могут быть достаточно удалены от самих границ. Во-вторых, с помощью генетических методов анализа эти мутации нельзя отличить от мутаций, затрагивающих кодирующие белок участки. (Точно так же неразличимы классические i u -мутации, затрагивающие промоторы или операторы и их структурные гены см. гл. 14.) [c.259]

Было обнаружено существование интересного сходства между митохондриальными интронами дрожжей и некоторыми генами рРНК. В их состав входит несколько довольно коротких сходных последовательностей. Они расположены на некотором расстоянии от границ экзон—интрон (на самих границах таких консервативных последовательностей нет). Некоторые последовательности причастны к сплайсингу, по крайней мере, в случае гена box, поскольку они обеспечивают создание сайтов, соответствующих 1/ш -мутациям box 9 и box 2, блокирующим сплайсинг. [c.260]

Молекула после сплайсинга становится ковалентнонепрерывной с наличием 5 -3 -фосфатной связи в сайте сплайсинга, но она также содержит 2 -фосфатную груп- [c.319]

Вторичная структура интронов во всех случаях разная. Предшественник из клеток с супрессорной мутацией имеет укороченный двухцепочечный стебель, и один конец интрона входит в состав двухцепочечного участка, а не одноцепочечного. Мутация al22 затрагивает область разрезания при сплайсинге, приводя к образованию большого неспаренного участка в двухцепочечном стебле другой конец интрона вследствие спаривания оснований входит в состав двухцепочечного участка, а не одноцепочечной петли. Таким образом, сайты сплайсинга узнаются ферментами независимо от того, располагаются ли они в области спаренных оснований или одноцепочечной области, и даже изменения на границе экзон—интрон приводят всего лишь к снижению эффективности сплайсинга и не приводят к замене сайтов сплайсинга. [c.319]

Общий вывод, который можно сделать на основе такого анализа, состоит в том, что конформация РНК может влиять на доступность точек разрезания при сплайсинге. При удалении определённых интронов конформа-хдая молекулы меняется, й становятся доступными новые пары сайтов сплайсинга. Но способность предшественника утрачивать интроны более чем в одном порядке указывает на то, что либо молекула может принимать разные конформации, либо при каждой конкретной конформации более чем одна пара сайтов может быть доступной разрезанию. [c.324]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология