Мутагенез с использованием олигонуклеотидов

Мутагенез с использованием олигонуклеотидов [c.290]

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ДНК фага М13 [c.159]

Каковы преимущества и недостатки олигонуклеотид-направленного мутагенеза с использованием бактериофага М13 и ПЦР [c.177]

Синтетические олигонуклеотиды используются в качестве линкеров или адаптеров для облегчения встраивания ДНК в векторы, затравок для ферментативного синтеза ДНК, а также затравок при секвенировании ДНК и РНК. Их применяют для сайт-направленного мутагенеза и как контрольные элементы для изучения экспрессии генов. Синтетические нуклеотиды используют также для конструирования полных генов. В зависимости от цели использования их длина варьирует от 5 до 60 нуклеотидов. Трудности, возникающие при получении длинных олигонуклеотидов, связаны не с собственно их синтезом, а с очисткой материала. [c.88]

Сайт-специфический мутагенез с использованием синтетических олигонуклеотидов гетеродуплексный метод. Синтетический олигонуклеотид служит праймером при синтезе мутантной вставки в рекомбинантном М 13-векторе. [c.348]

Один из методов химического мутагенеза использовали для замены цитозина на ТИМИН. Для этого ДНК обрабатывали бисульфитом натрия, который при подходящих условиях действует лишь на специфический участок ДНК [43]. Созданы также методы, позволяющие воздействовать на относительно специфические участки нуклеотидной последовательности одноцепочечной ДНК и, после ресинтеза, включать неспари-вающиеся или неправильные основания [44]. Однако в этих методах нельзя точно задать положение точки мутации таким образом, чтобы найти необходимый белок, требуется скрининг множества мутантов. Обойти эту проблему можно посредством мутагенеза с использованием олигонуклеотидов, что открывает путь к введению в ДНК специфических точечных мутаций. [c.102]

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием плазмидной ДНК Основной недостаток олигонуклеотид-направ-ленного мутагенеза с использованием фага М13 -большое число процедур. Чтобы выделить мутантную форму нужного гена, приходится затратить много времени. В качестве альтернативы системе с использованием фага М13 было разработано множество других подходов, основанных на применении плазмидных ДНК. Это позволяет обойтись без переноса Интересующего исследователя гена из плазмиды в фаговую ДНК, а после завершения мутагенеза - обратно в плазмиду. Один из этих подходов включает встраивание ДНК в плазмидный вектор, который несет функциональный ген устойчивости к тетрациклину и неактивный ген устойчивости к ампициллину в середине последнего заменен один нуклеотид (рис. 8.3). Клетки Е. соИ трансформируют вектором, несущим ДНК-мишень, и двухцепочечную плазмидную ДНК денатурируют щелочью с тем, чтобы получить одноцепочечные кольцевые молекулы. Денатурированную ДНК отжигают с тремя разными олигонуклеоти- [c.161]

Рис. 8.3. Олигонуклеотид-направлен-ный мутагенез с использованием плазмидной ДНК. Ген-мишень встраивают в полилинкер вектора pALTER. Плазмидную ДНК денатурируют в щелочи и отжигают с тремя олигонуклеотидами мутагенным олигонуклеотидом, олигонуклеотидом, восстанавливающим устойчивость к ампициллину (Amp ), и олигонуклеотидом, придающим чувствительность к тетрациклину (Tef ). Эти олигонуклеотиды служат затравками для синтеза ДНК с помощью ДНК-по-лимеразы Т4, а исходная цепь - матрицей. Одноцепочечные разрывы в новосинтезированной цепи зашиваются ДНК-лигазой Т4. Продуктами реакции трансформируют клетки Е. соН и отбирают трансформантов Amp и Tet.

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР-амплификации Более простой и быстрый метод получения больших количеств мутантных генов, альтернативный системе с использованием фага М13, -сайт-специфический мутагенез в сочетании с полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Один из вариантов этого подхода состоит в следующем. Ген-мишень встраивают в плазмидный вектор (рис. 8.4) и помещают препарат в две пробирки. В каждую из них добавляют по два специфических праймера для ПЦР 1 и 2 в одну пробирку, 3 и 4 - в другую. Праймеры 2 и 3 полностью комплементарны одному из участков клонированного гена или прилегающей к нему последовательности, а 1 и 3 комплементарны другому участку, но содержат один некомплементарный нуклеотид и гибридизуются с разными цепями, так что в результате происходит замена обоих нуклеотидов данной пары. Положение сайтов гибридизации праймеров 1 и 2 в одной пробирке и 3 и 4 - в другой таково, что ПЦР-продукты в разных пробирках имеют разные концы. По окончании ПЦР содержимое пробирок объединяют и проводят денатурацию, а затем ренатура-цию. Поскольку концы амплифицированных молекул ДНК из двух пробирок неодинаковы, одноцепочечные ДНК из разных пробирок ассоциируют с образованием кольцевьгх молекул с [c.163]

Рис. 8.4. Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР. Реакцию проводят в двух пробирках, в каждой из которых содержится одинаковая двухцепочечная плазмидная ДНК, но разные наборы праймеров. Праймеры 1 и 3 содержат один неспаривающийся нуклеотид и комплементарны разным цепям плазмидной ДНК. Праймеры 2 и 4 полностью комплементарны соответствующим участкам плазмидной ДНК и тоже гибридизуются с разными цепями. Положение сайтов гибридизации для праймеров каждой пары различается, но их концы стыкуются. В результате ПЦР-амплификации образуются линейные молекулы. По окончании реакции содержимое пробирок смещивают и проводят денатурацию, а затем ренатурацию. В результате кроме двух исходных линейных амплифицированных молекул образуются две кольцевые плазмидные ДНК, каждая с двумя одноцепочечными разрывами. После трансформации кольцевыми молекулами клеток Е. соН разрывы репарируются ферментами клетки-хозяина, и плазмида может реплицироваться независимо. Линейные молекулы ДНК в Е. oli не сохраняются.

Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием векторов на основе фага М13 эффективный универсальный метод внесения точковых мутапий в любой фрагмент ДНК [c.165]

Рис. 8.6. Случайный мутагенез с использованием вырожденных олигонуклеотидов и ПЦР. Левую и правую части гена-мишени амплифицируют по отдельности с помощью ПЦР. Соответствующие праймеры показаны горизонтальными стрелками. Вырожденные олигонуклеотиды изображены стрелками с тремя зазубринами, каждая из которых отвечает нуклеотиду, не комплементарному соответствующему нуклеотиду в гене-мишени. Амплифици-рованные фрагменты очищают, денатурируют до полного разделения цепей и ренатури-руют. В результате образуются частично двухцепочечные молекулы ДНК, спаренные в области гена-мищени. Их достраивают с помощью ДНК-полимеразы и проводят ПЦР-амплификацию. ПЦР-продукты расщепляют эндонуклеазами рестрикции А и В и встраивают в вектор, обработанный теми же ферментами.

Опищите стратегию олигонуклеотид-направленного мутагенеза с использованием плазмидной ДНК. [c.177]

При реализации такого подхода из гена, клонированного в составе векторной плазмиды, по двум близко расположенным уникальным сайтам рестрикции вырезается фрагмент ДНК, в который требуется внести мутации, и на его место встраивается синтетический двухцепочечный олигонуклеотид, содержащий необходимые замены нуклеотидов (кассету мутаций). В этом случае, если в окрестностях мутагенизируемого локуса гена отсутствуют подходящие природные сайты рестрикции, их вводят с помощью направленного мутагенеза. Разработка автоматических синтезаторов ДНК сделала синтез олигодезоксирибонук-леотидов простой и даже рутинной процедурой. Более того, использование на некоторых этапах синтеза вместо одного нуклеотида смеси из двух, трех или даже всех четырех дезоксирибо-нуклеозидтрифосфатов позволяет получать за один прием сложную смесь олигонуклеотидов, которые могут содержать в определенных сайтах наборы кодонов для многих или даже всех 20 природных аминокислот. Это дает возможность осуществлять одновременный скрининг по искомому мутантному фенотипу большого числа разных мутантных клонов, полученных в одном цикле клонирования. С помощью кассетного мутагенеза можно определять функциональную роль отдельных сайтов и целых доменов в полипептидных цепях конкретных белков и создавать рекомбинантные белки с новыми, подчас неожиданными свойствами. [c.323]

Кленовский фрагмент ДНК-полимеразы I применяют также для синтеза второй нити кДНК (см. с. 182). для определения последовательности нуклеотидов в ДИК по методу Сэнгера (см. гл. 9), для сайт-специфического мутагенеза ДИК с использованием синтетических олигонуклеотидов (см. гл. 8). Скорость работы этого фермента т vitro при оптимальных условиях - около 30 нуклеотидов в секунду. [c.178]

В 1978-1979 гг. С. Джиллам и М. Смит с соавторами экспериментально обосновали возможность использования синтетических олигонуклеотидов в качестве мутагенов (рис. 6.10, а). Объектом мутагенеза авторы выбрали фаг 0X174, имеющий небольшую одноцепочечную кольцевую ДНК, для которой уже была известна последовательность нуклеотидов. Одноцепочечную кольцевую ДНК гибридизовали с синтетическим олигонуклеотидом, имевшим определенные отличия от соответствующей последовательности фагового генома, например точечную замену одного из нуклеотидов. Данный олигонуклеотид использовали в качестве праймера для достройки второй цепи на ДНК- [c.180]

Пионерские работы по олигонуклеотид-на-правленному мутагенезу фага М13 и гибридов на его основе провели Дж. Мессинг с сотрудниками (1981-1983 гг.). Они продемонстрировали возможность вводить в геном фага с помощью олигонуклеотидов направленные замены, вставки, делеции (рис. 6.11). Таким путем, в частности, получены новые векторные производные серии Ml Зтр (рис. 6.12). Важной особенностью данного метода является то, что олигонуклеотид-мутаген может быть использован для эффективного отбора получаемых мутантных клонов. С этой целью выросшие после трансфекции клоны ДНК гибридизуют на нитроцеллюлозе с З2р меченным синтетическим олигонуклеотидом-мутагеном при низкой температуре, а затем осуществляют последовательные отмывки радиоактивного зонда при повы- [c.183]

Дж. Крамер с сотрудниками показали, что выход целевых мутантов значительно увеличивается при использовании штаммов Е. соН, дефектных по системе репарации. П. Картер с соавторами (1985 г.), учтя опыт предшественников, предложили метод амбер-селекции цепей ДНК. В качестве матрицы берется ДНК фага М13 с амбер-мутацией в районе, который не планируется подвергать мутагенезу (см. рис. 6.13). Наряду с олигонуклеотидом-мутагеном к такой ДНК добавляют второй праймер (синтетический или природный одноцепочечный фрагмент ДНК), комплементарный участку с амбер-мутацией, но имеющий последовательность дикого типа в этом локусе. Таким образом формируется система двойного праймирования. После завершения полимеразной реакции и лигирова- [c.184]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология