Векторная ДНК

Трансфекция векторной ДНК в упаковывающие клетки [c.288]

Рис. 6.11. Образование случайно ориентированных тандемных повторов. А. Клонированные гены вырезают из клонирующего вектора с помощью рестрицирующей эндонуклеазы Abel и отделяют от векторной ДНК. . Создают условия, при которых происходит сшивание вырезанных генов. Поскольку нуклеотидные последовательности обоих выступающих концов генов одинаковы, последние могут соединяться в любой ориентации. В результате образуются тандемные повторы из случайно ориентированных последовательностей.

Одной из них стало введение свободной ДНК, называемой также векторной ДНК или просто вектором, в протопласты — растительные клетки без стенок (оболочек). Их удаляют, помещая эксплантаты в раствор ферментов из низших грибов. Дело в том, что клеточная стенка — серьезное препятствие для ДНК. В протопластах же единственной защитой остается плазматическая мембрана. Обычно ДНК внедряют в протопласты, используя полиэти-ленгликоль (плотный органический полимер, проникающий сквозь мембрану) или электрический пробой, при котором мембрану протыкает импульс напряжения. Эти процедуры не связаны с биологическими взаимодействиями и пригодны для любых клеток. Но получить полноценное растение из изолированных протопластов нелегко лишенная стенки клетка с трудом ее восстанавливает. К тому же регенерировать целое растение из изолированной клетки гораздо сложнее, чем из клетки или клеток в составе [c.103]

Е. соИ. При последующей репликации векторной ДНК в комплементарную цепь включаются нуклеотиды, отличные от исходных, в том сайте, где находится аналог нуклеотида. В результате в клонированный ген вносится мутация. [c.167]

Использование ретровирусных векторов имеет и еще один большой недостаток. Хотя эти векторы создаются так, чтобы они были дефектными по репликации, геном штамма ретровируса (вируса-помощника), который необходим для получения большого количества векторной ДНК, может попасть в то же ядро, что и трансген. Несмотря на все принимаемые меры, ретровирусы-помощники могут реплицироваться в организме трансгенного животного, что совершенно недопустимо, если этих животных предполагается использовать в пищу или как инструмент для получения коммерческого продукта. И поскольку существуют альтернативные методы трансгеноза, ретровирусные векторы редко используются для создания трансгенных животных, имеющих коммерческую ценность. [c.419]

Трансфекция осуществляется так же, как описано в табл. 9.1., но следует взять только 0,5 мкг векторной ДНК (в расчете на одну чашку), смешав ее предварительно с 10 мкг ДНК-носителя (например, ДНК спермы лосося). Если вектор не содержит маркерного гена neo, включите в преципитат [c.290]

Трансформация растительных протопластов изолирован ной векторной ДНК......... [c.4]

Рис. 9.4. Линейная карта вектора pMV-7, содержащего внутренний промотор [26]. pMV-7 — производное Mo-MSV, содержит уникальные рестрикционные сайты oRI и h indlU, которые используются для клонирования генов, функцию селективного маркера выполняет ген neo под контролем .4-промотора (Р(к) вируса герпеса простого. Волнистой линией обозначены ген устойчивости к ампициллину (Лр ) и другие плазмидные последовательности, которых нет в вирусных геномах — производных векторной ДНК.

При молекулярном клонировании важно, чтобы расщепление донорной и векторной ДНК происходило в строго определенньгх участках (сайтах) с образованием дискретного и воспроизводимого набора фрагментов. Если пропустить хромосомную ДНК через шприц с иглой малого диаметра или обработать ее ультразвуком, то мы получим фрагменты длиной от 0,3 до 5 т.п.н. К сожалению, в ходе этих простых операций разрывы двухцепочечных молекул происходят случайным образом, так что при каждой обработке препарата ДНК получается совершенно новый набор фрагментов. Молекулярное клонирование стало возможным только после вьщеления высокоспецифичных бактериальных ферментов, которые узнают определенные последовательности оснований в двухцепочечной молекуле ДНК и расщепляют обе цепи. Эти ферменты называются рест-рицирующими эндонуклеазами типа II. [c.50]

М 13-векторов, содержащих перекрывающиеся субклонированные последовательности, значительно увеличивается. Чтобы решить эту задачу, были разработаны методы секвенирования двухцепочечных плазмидных ДНК, не требующие субклонирования. Плазмидную ДНК, содержащую нужную вставку, вьщеляют и отжигают с синтетическим олигонуклеотидным праймером, который гибридизуется с последовательностью в одной из цепей векторной ДНК, находящейся вблизи вставки. Затем осуществляют дидезокси-секвенирование, позволяющее идентифицировать первые 250-350 нуклеотидов вставки. Исходя из этих данных синтезируют второй олигонуклеотидный праймер, комплементарный сегменту вставки, отстоящему примерно на 300 нуклеотидов от места связывания первого праймера, и секвенируют следующие 250-350 нуклеотидов. Аналогичным образом синтезируют третий праймер и определяют нуклеотидную последовательность следующих 250—350 нуклеотидов (рис. 5.17). Эту процедуру, называемую праймер-опосредованной прогулкой, продолжают до тех пор, пока не секвенируют весь фрагмент. Аналогичным образом секвенируют вторую цепь, начиная с праймера, который гибридизуется с этой цепью вблизи вставки. [c.93]

Рис. 19.6. Идентификация клеток, несущих трансген в специфическом сайте, при помощи ПЦР. А. В результате неспецифического встраивания векторной ДНК один из праймеров (Р2) не сможет гибридизоваться с участком хромосомы, находящимся на определенном расстоянии от места отжига праймера Р1, и фрагмента нужного размера при амплификации не образуется. Р1 гибридизуется с уникальным участком (118) встроенной ДНК, отсутствующим в хромосомной ДНК клетки-реципиента. Б. В результате гомологичной рекомбинации между участками НВ1 и НВ2 встраиваемой ДНК, с одной стороны, и комплементарными участками хромосомы С81 и С82, с другой, образуются участки, с которыми могут гибридизоваться оба праймера, Р1 и Р2, и которые находятся на определенном расстоянии друг от друга. В ходе ПЦР-амплификации синтезируются фрагменты одного размера, которые можно идентифицировать при помощи гель-электрофореза. Если ПЦР-продукт нужной длины образовался, значит трансген (ТО), находящийся между гомологичными участками (НВ1 и НВ2), встроился в определенный сайт хромосомы.

Основное требование, предъявляемое к клонирующему вектору, состоит в том, что он должен содержать участок, куда чужеродная ДНК может быть встроена без нарушения какой-либо важной функции. Самый простой способ решения этой проблемы-подобрать фермент рестрикции, вносящий единственный разрыв в такой участок векторной ДНК. Далее необходимо суметь отделить химерный геном от исходного вектора, так как иначе после клонирования будет трудно выделить химерный геном из всей массы материала. [c.236]

Структуру участков хроматина, содержащих гены, клонированные в составе рекомбинантных векторных ДНК, можно изучать непосредственно на интактных ядерных ДНК, в качестве критерия используя различия в чувствительности к действию нуклеаз. Участки ДНК, входящие в область открытых хроматиновых структур, более доступны нуклеазной атаке, чем участки, существующие в виде более компактных структурных образований. [c.221]

СИТ ОТ качества препарата ФКТ фермент используют в минимальном количестве в. буфере, описанном в разд. 2.2.1.4. В результате реакции образуются желаемые нелигируемые концы векторной ДНК. [c.48]

Процент клонов, содержащих вставки гетерологичной ДНК, резко возрастает, если концы векторной ДНК перед лигирова-нием обработать щелочной фосфатазой из кишечника теленка (ФКТ, IP). Удаление 5 -концевых фосфатов векторной ДНК препятствует внутримолекулярному лигированию. Поскольку РНК в качестве субстрата для щелочной фосфатазы является активным конкурентом ДНК, важно, чтобы препарат ДНК плазмиды pUR был свободен от РНК. [c.143]

Молекулы векторной ДНК, введенные в клетку с помощью трансфекции, часто соединяются друг с другом, образуя высокомолекулярные формы, так что в хромосому клетки-хозяина в одно и то же место внедряется сразу целый набор плазмид. Поэтому амплифицируемый маркер и неселектируемый ген необязательно должны находиться в составе одного вектора, а могут присутствовать в разных плазмидах, которые вводят в клетку путем ко-трансфекции. С другой стороны, надо учитывать и возможность интеграции в хромосому лишь юдной копии вектора. Поэтому в общем случае лучше использовать один вектор, в котором есть все нужные гены. Для введения интересующего гена у многих векторов, описанных в разд. 8.2, после амплифицируемого гена располагается участок узнавания рестриктазы ВатШ, в который можно встроить полный транскриптон (рис. [c.261]

Растворите 10—20 мкг векторной ДНК в 0,5 мл стерильного раствора 250 мМ СаС12. По каплям, постоянно перемешивая, прилейте этот раствор к 0,5 мл стерильного 2ХНВ5 >. Оставьте при комнатной температуре на 15 мин, чтобы сформировался осадок. [c.289]

Альтернативой введению ретровирусной векторной ДНК в упаковывающие клетки для получения вирусных препаратов, свободных от хелперных компонентов, служит использование любых других клеток, несущих рекомбинантную провирусную ДНК, в которые вводится путем трансфекции хелперный геном MLV с делетированным собственным упаковывающим сигналом. Эта процедура с высокой эффективностью превращает исходные клетки в упаковывающие. Метод особенно удобен в тех случаях, когда требуется получить рекомбинантный впрус из клеток, в которых уже содержится провирусная ДНК. [c.291]

ДНК вектора и встраиваемую ДНК расщепляют по отдельности, так как важно добиться такого расщепления векторной ДНК, чтобы нерасщепленной осталось около одной молекулы ДНК фага A на 10 расщепленных молекул. Легко получить препарат ДНК фага К, не загрязненный ингибиторами эндонуклеаз. В то же время многие препараты клеточной ДНК содержат такие ингибиторы. Если проводить совместное расщепление клеточной и фаговой ДНК, то присутствие ингибитора в препарате клеточной ДНК приведет к тому, что вероятность нерасщепленной ДНК фага A окажется выше, чем 10 . Чтобы получить заведомо полное расщепление, нужно брать эндонуклеазы- больше, чем это было определено на этапе 3. Этот этап имеет существенное значение только для векторной ДНК фага A. Присутствие 10— нерасщепленной ДНК фага К нельзя обнаружить по результату электрофореза в геле, но легко выявить по инфекционности. Для более высокой эффективности упаковки in vitro липкие концы ДНК фага A должны быть соединены, а для более эффективной трансфекции они должны оставаться свободными. Энергия активации соединения липких концов ДНК фага A высока, и потому для их эффективного соединения необходима высокая температура (50°С). При 0°С соединение липких концов ДНК фага % происходит крайне медленно. Поэтому липкие концы, образующиеся под действием рестриктирующей эндонуклеазы, можно полностью соединить, не соединив в то же время липких концов ДНК фага A (разд. П). [c.96]

I. Переносят векторную ДНК и ДНК вставки в м икроцентри-фужную пробирку Эппендорф в общем объеме до 15 мкл и помещают на лед. [c.60]

Приведенные выше соображения в равной степени относятся к выделению трансформантов из клеточных суспензий, совместно культивированных с Agroba terium tumefa iens (разд. 2.10), и популяций протопластов, трансформированных путем прямого поглощения векторной ДНК (гл. 3). Описанные методы можно применять для селекции трансформированных колоний во всех экспериментах, подразумевающих использование больших популяций малых гомогенных эксплантатов. [c.156]

Введение нуклеиновых кислот в растительные протопласть нельзя считать новым методом. Уже в течение многих лет его используют для изучения распространения, репликации и экспрессии вирусов растений. Действительно, большинство современных методов введения векторной ДНК в протопласты растений было первоначально разработано для вирусных нуклеиновых кислот и основывалось на аналогичных подходах используемых при работе с вирусами животных. [c.196]

Доступность относительно больших количеств векторной ДНК с эффективно экспрессирующимися селективными/скрини-руемыми генами возродила интерес к трансформации посредством ДНК, и многие исследователи быстро оптимизировали целый набор методик для достижения эффективной доставки векторной ДНК в растительные протопласты, подразумевающие использование липосом, полиэтиленгликоля и электропорацию [c.198]

Смотреть страницы где упоминается термин Векторная ДНК: [c.141] [c.51] [c.56] [c.77] [c.141] [c.142] [c.143] [c.144] [c.379] [c.422] [c.502] [c.195] [c.137] [c.280] [c.143] [c.280] [c.303] [c.304] [c.33] [c.33] [c.196] [c.196] [c.197]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология