Препаративный электрофорез белков

Важнейшая проблема при конструировании приборов для препаративного электрофореза — это необходимость эффективного отвода тепла, с тем чтобы все части системы находились при постоянной температуре. Поэтому приходится идти на компромисс между желанием ослабить белок-белковые взаимодействия путем повышения концентрации соли и стремлением уменьшить тепловыделение путем понижения концентрации соли. Все присутствующие в системе соли обычно входят в состав буфера (при этом нет никакой необходимости использовать сильные буферы, если продукты электролиза отделены от белков). Можно применять буферные смеси с низкой проводимостью, в которых ионные компоненты имеют относительно большие размеры и низкую электрофоретическую подвижность, например Н-трис+. В составе буфера эти ионы еще менее подвижны, поскольку часть времени они находятся в незаряженном состоянии, например борат-5=ьН-борат. Поэтому трис-бо-ратный буфер с pH 8—9 —один из самых популярных буферов для электрофореза. При pH 7—8 в качестве буфера с низкой проводимостью рекомендуется трис-МОПС (МОПС — морфоли-нопропансульфонат). Электрофорез обычно проводят при нейтральных или слабощелочных pH, когда большинство белков мигрирует к аподу. [c.215]

В сравнении с хроматографическими методами все другие способы очистки белков за последние годы начинают несколько отступать на задний план. Все же следует упомянуть здесь о препаративном электрофорезе, который применяется довольно широко в разных исполнениях. Для фракционирования малых весовых количеств белков разделение смеси белков на зоны ведут в том или ином стабилизирующем наполнителе для ликвидации конвекционного перемешивания. Пригодными наполнителями являются волокна целлюлозы, в частности бумага. Бумажный электрофорез белков похож на разделение аминокислот и пептидов на бумаге, о чем мы уже говорили выше. Другой широко употребительной средой является гель крахмала, который разрезается на кусочки после завершения электрофореза, и из каждого куска элюируется содержащийся в нем белок. [c.131]

Препаративный электрофорез в акриламидном геле может быть использован на любой стадии очистки гибридного белка для его выделения в качестве неповрежденного, но денатурированного иммуногена. ДСН-лизаты клеток, полученные, как описано выше в разд. 5.3.2, после осветления центрифугированием могут быть непосредственно нанесены на гель. Белок примерно из 15 мл клеток, лизированных в 1,25 мл буфера для нанесения, содержащего 1,5% ДСН, можно исследовать, используя одну пластину геля с площадью поперечного сечения 2,0 см . [c.155]

Зоны, представляющие интерес, вырезают и белок выделяют экстракцией [49, 64] или элюированием в условиях электрофореза [2, 175]. При определении аминокислотного состава приготовленных таким способом образцов обязательно вводят необходимые поправки, учитывающие присутствие акриламид-ного геля [26]. Согласно другому варианту, белки разделяют электрофорезом в блоке акриламидного геля, при этом под действием электрического поля белковые фракции попадают в проточную камеру, откуда и вымываются раздельно потоком элюэнта. Ход элюирования регистрируют с помощью проточного денситометра, элюат собирают на фракционном коллекторе. Недавно разработана методика элюирования белков из системы ПААГ —ДСН в промежуточный гель с использованием восходящего электрофореза [121]. Выход достигается высокий, однако образец может содержать примеси компонентов акриламидного геля и буферной системы. Гели для препаративного электрофореза могут иметь форму столбиков (LKB) или пластин (блоков) (Biorad). Для разделений по описанной методике 1 сп()льзуют различную аппаратуру, выпускаемую фирмами. [c.39]

С момента разработки этого метода гель-хроматография наиболее часто используется для препаративного фракционирования белков, причем обычно как первый этап разделения. Поскольку разрешающая способность этого метода низка, хроматографические фракции могут содержать несколько компонентов и необходимо дальнейшее разделение другими способами. Анализ смеси неизвестного состава первоначально проводят на гелевой матрице с широким диапазоном фракционирования, собирают фракцию, содержащую интересующий белок, и разделяют ее на геле с 0олее узким диапазоном фракционирования. Выделенную в результате фракцию разделяют далее методом ионообменной хроматографии или электрофореза. [c.106]

Градиент pH используется не только в диск-электрофорезе, но и при электрофорезе с достижением изоэлектрической точки. (Изоэлектрическая точка — значение pH, при котором амфолит (молекулы, содержащие катионные и анионные группы, например, белок) теряет заряд и в электрическом поле не движется.) Если смесь белков разделять электрофоретически в градиенте pH, то каждый белок будет двигаться до достижения своей изоэлектрической точки. В результате отдельные белки как бы сфокусированы в отдельных зонах. Поэтому этот метод еще носит название изоэлектрической фокусировки. Он используется не только в аналитических, но и в препаративных целях. Особенно часто он применяется на первых этапах очистки белков, так как позволяет быстро и с высоким разрешением фракционировать довольно большие (граммы) количества образца. [c.114]

Гель-электрофорез используют не только для aHajiHTH4e KHX, но и для препаративных целей. Отмечено также, что связывание белка с фрагментом ДНК уменьшает его электрофоретическую подвижность, позволяя таким образом изучать особенности взаимодействия белок-ДНК. [c.465]

Проводимости белковых молекул настолько низки, что устойчивая граница может существовать лишь при чрезвычайно высоких потенциалах, представляющих к тому же опасность для персонала лаборатории. Чтобы избежать этого, препаративный изотахофорез белков проводят в присутствии амфолитов, которые ипрают роль прокладок (spa ers), имеющих промежуточную по сравнению с белковыми компонентами подвижность. Эти прокладки увеличивают проводимость и способствуют образованию более устойчивых границ между компонентами. Их присутствие облегчает также создание градиента pH. Таким об разом, изотахофорез белков сходен с изоэлектрическим фокусированием, за исключением того, что компоненты в случае изотахофореза продолжают перемещаться (и со временем выходят из колонки), причем индивидуальные компоненты никогда не достигают области, где значения ipH соответствуют их изоэлектрическим точкам. Этам способом удается преодолеть три недостатка изоэлектрического фокусирования. Белок способен выходить из канала разделения и может быть собран так же, как и при простом электрофорезе. Неустойчивость белков в их изоэлекпрических точках перестает быть проблемой, если сохраняется более высокое значение pH (или более низкое при изменении общего направления потока). Не нужно также опасаться не растворимости белка в изоэлектрической точке. Основной недостаток этого метода по сравнению с изоэлектрическим фокусированием заключается в том, что он обладает [c.234]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология