Тиогидантоины, идентификация

А. 1.3. Идентификация тиогидантоинов. После отщепления тиогидантоинов от небольших пептидов можно проводить аминокислотный анализ укороченного пептида и определять С-концевую аминокислоту по разности аминокислотного состава пептидов до и после отщепления. Для белков следует про- [c.503]

Модификацией метода Эдмана является применение метилизотиоцианата вместо фенилизотиоцнаната. При этом Н-концевая аминокислота отщепляется в виде метил-тиогидантоина (В. М. Степанов, В. Ф. Кривцов, 1963). Дальнейшее весьма перспективное развитие метода Эдмана состоит в совмещении его с масс-спектрометрической идентификацией отщепляемых от пептида Н-концевых аминокислот в виде фенил- или ме-тилтиогидантоинов (Н. С. Вульфсон, В. М. Степанов, В. А. Пучков, А. М. Зякун 1963. 1964).— Прим. ред. [c.691]

Огносительно неустойчивое производное 2-анилино-5 и-азолинона непригодно для идентификации аминокислоты. Оно м.б. превращено в изомерныи 1-фенилимидазолидин (тиогидантоин П) при нагр. в кислой среде или путем гидролиза (с размыканием цикла и послед, циклизацией) [c.404]

Независимо от того, какая модификация метода Эдмана используется, после каждого цикла необходимо собирать производные 2-анилинотиазолона-5 Л -концевых аминокислот и превращать их в 2-тио-З-фенилгидантоины (12) нагреванием с трифторуксусной кислотой. Известно несколь <о методов [23] идентификации 2-тио-гидантоинов. До того, как были разработаны удобные способы отделения 2-тиогидантоинов, широко использовали их гидролиз до аминокислот, так как для идентификации и количественного определения можно использовать аминокислотный анализатор. При гидролизе, однако, неизбежно разрушаются некоторые гидантоины (например, гидантоинозые производные серина и треонина), и в настоящее врем предпочитают методы прямого их определения. [c.270]

Хорошо известный метод Эдмана для определения аминокислотной последовательности в пептидах основан на образовании тиогидантоинов (12) за счет концевой аминокислоты при действии на пептиды соответствующего RN = = S. Масс-спектры таких тиогидантоинов достаточно характеристичны и облегчают задачу идентификации отщепленной аминокислоты [507]. Масс-спектры фенилтиогидантоинов (12, R = 6Hs), например, всегда содержат интенсивные пики М+ и пики ионов [СбН5]+ и [ eH5N = = S] + - (m/z 135). Если в (12) К >СНз, то из М+ легко отщепляется молекула (R —Н). [c.291]

Превращение N-концевого аминокислотного остатка в тиогидантоин приводит к укорочению анализируемой полипептидной цепи на одно звено. Выделив этот пептид, исследователь получает возможность повторить всю процедуру, установить природу второго аминокислотного остатка и выделить полипептид, укороченный на два звена. Многократное повторение такой ступенчатой деградаций дает возможность последовательно идентифицировать все составляющие исходный полипептид остатки аминокислот, т.е. установить его первичную структуру. Практически в ручном варианте метод Эдмана позволяет сделать один-два десятка шагов. Работа сводится к многократному повторению одних и тех же чередую-пщхся процедур добавления изотиоцианата, отщепления тиогидантоина, отделения его от укороченного пептида для последующей идентификации, выделение оставшегося полипептида в виде, пригодном длЯ следующего шага обработки. Чтобы избавить исследователей от такой монотонной работы, требующей вместе с тем строгого соблюдения условий эксперимента на каждом шаге, созданы специальные автоматизированные установки для проведения всех перечисленных операций — автоматические секвенатори полипептидов. С их помсоцью удается провести до 40 — 60 шагов ступенчатой деградации. [c.271]

Усовершенствование методики разделения и идентификации аминокислот в белковых гидролизатах заключается в превращении кислот в З-фенил-2-тиогидантоины действием фенилизотиоциа-ната [155] с последующим разделением их при помощи бумажной хроматографии или хроматографии на колонках [156]. Для количественных определений достаточно 10 мкг кислоты максимум адсорбции определяли при 269 ммк (кроме серина и треонина). [c.396]

При изучении масс-спектров фенилтио- [690] и метилтиогидан-тоинов [691] аминокислот было впервые показано, что масс-спектры этих производных позволяют определить строение аминокислоты, из которой получен соответствующий тиогидантоин. Была показана возможность идентификации аминокислот по характеристическим пикам в масс-спектрах эфиров их Л -ацильных производных [692] [c.289]

Френкель-Конрат при отщеплении N-концевых аминокислот по способу Эдмана (см. стр. 171). Этим методом было подтверждено наличие С-концевого аланина у альбумина сыворотки крови лошади. Очень часто вследствие побочных реакций получают низкие выходы 2-тиогидантоинов по-видимому, идентификацию отщепляемой аминокислоты лучше осуществить путем сопоставления аминокислотного состава исходного и укороченного пептида или белка (т. е. по разности). Фокс и др. показали [51], что аминокислоты лизоцима (кроме С-концевого остатка) не разрушаются при обработке по методу Шлака и Кампфа точный аминокислотный анализ после кислотного гидролиза показал потерю 1 остатка лейцина на 1 моль лизоцима (мол. вес 14 700). [c.210]

Первоначальная реакция полипептида с фепилизотиоцианатом [схема (13), реакция I] проводится в присутствии пиридина и воды при pH 8,6. Пиридин и избыток реагента удаляют повторной экстракцией бензолом и фенилтиокарбамил(ФТК)-пептид лиофилизуют для удаления всей воды. Реакцию расщепления [схема (13), II] проводят с безводным хлористым водородом в нитрометане, причем фактором, определяющим скорость реакции, является растворимость ФТК-пептида в нитрометане. Оставшийся полипептид, который нерастворим в нитрометане, отделяют затем от растворимого анилинотиазолинона. Превращение последнего вещества в фенилтио-гидантоин (ФТГ) происходит в две стадии, из которых первая — гидролиз (III) — идет очень быстро и без осложняющих побочных реакций, тогда как вторая (реакция IV) протекает медленнее и катализируется ионами водорода. Ильзе и Эдман [130] нашли, что оптимальными условиями превращения ФТК-аминокислот в тиогидантоины является нагревание при 80° и pH 1 в течение 1 час. В этих условиях получаются количественные выходы гидантоинов из большинства аминокислот, исключая глицин (выход 85%), который реагирует медленно, а также серин (20%) и треонин, которые частично теряются в побочных реакциях, включающих дегидратацию за счет р-элиминирования в боковой цепи. Несмотря на это, выход ФТГ даже из серина достаточен для удовлетворительной идентификации его на бумажных хроматограммах. [c.154]

Первоначально в методе Эдмана тиогидантоины подвергали щелочному гидролизу для освобождения аминокислот, которые идентифицировали хроматографией на бумаге [129]. Аргинин и триптофан давали по два пятна, что затрудняло идентификацию. Сёквист [131] преодолел эту трудность, применив непосредственную хроматографию фТГ на бумаге и обнаруживая зоны реакцией с иодом и азидом [132]. Эдман и Сёквист [133] разработали количественный метод элюирования пятен ФТГ с последующим определением их ультрафиолетового поглощения при 270 ммк. [c.154]

С появлением ВЭЖХ и высокочувствительных проточных детекторов стал возможным анализ на микроуровне с идентификацией пикомольных количеств вещества. Чувствительность микроанализа ограничивается чистотой производных, их стабильностью в ходе и после отщепления, наличием примесей. Обязательное условие — высокая чистота растворителей для устранения возможности загрязнения секвенатор, во-первых, должен иметь минимальные мертвые объемы и некорродирующие клапаны и соединения, во-вторых, необходимо постоянно поддерживать на высоком уровне технические параметры прибора. Лимитирующими факторами в жидкофазном анализе является качество полибрепа, в твердофазном — качество носителей. Дополнительно осложняет анализ существенное различие выходов отдельных производных. Некоторые тиогидантоины отщепляются с высокими выходами и устойчивы, другие присутствуют в малых количествах, так как они либо плохо отщепляются, либо разрушаются после отщепления в любом случае их трудно обнаружить на фоне побочных продуктов. Следует тщательно контролировать техническое состояние прибора для того, чтобы быть уверенным в результатах тех анализов, где [c.401]

ТФ-подход значительно стимулировал развитие работ по тиоцианатному расш еплению, хотя до сих пор не удавалось отщепить более 6 аминокислот. Особые сложности возникают при анализе как самих остатков Asn, Asp, Glu, Pro, так и остатков, следующих за ними. Pro отщепляется на первой же операции своего цикла отщепления (обработка тиоцианатом аммония), поэтому вместе с ним в продуктах того же цикла появляется следующая аминокислота [58]. Отщепление других вышеприведенных аминокислот происходит с низкими выходами. Идентификацию тиогидантоинов проводили различными методами без использования преимуществ высокочувствительной фотометрии. Трудно оценить возможность определения длинных участков последовательности без проведения дополнительной вдумчивой и систематической работы. Мы надеемся, что подобное исследование будет продолжено, так как С-концевые отщепления могут очень полезно дополнять анализ N-концевой последовательности. Кроме того, количественное присоединение пептидов по а-аминогруппе к нерастворимому носителю происходит в целом значительно легче, чем конденсация по С-концевому карбоксилу. [c.455]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология