Ферментативное расщепление нуклеиновых кислот

Таблица 26.1. Ферментативное расщепление нуклеиновых кислот

При определенных условиях расщепления рибонуклеиновых кислот образуются циклические фосфаты, представляющие собой д -эфиры ортофосфорной кислоты с 2 - и З -гидроксильными группами рибозы. Они называются нуклеозид-2, З -циклофосфатами и обозначаются N > р (например, адеиозин-2, З -циклофосфат, или А> р). Циклофосфаты типа (а) N(1 , 5 ) > р не образуются при расщеплении нуклеиновых кислот. Некоторые из иих, иапример аденозин-3 , 5 -циклофосфат (см. с. 240), являются продуктами ферментативных реакций, протекающих в клетке, и играют важную биологическую роль. [c.301]

Распад нуклеопротеида на нуклеиновую кислоту и белок в желудке может происходить либо под действием кислоты желудочного сока (т. е. не ферментативным путем), если разрываются солеобразные связи между нуклеиновой кислотой и белком, имеющим щелочные свойства, либо в результате действия пепсина, если эти связи устойчивы при pH желудочного сока, либо и под влиянием кислоты, и под влиянием пепсина. В кишечнике расщепление нуклеопротеидов на белок и нуклеиновую кислоту происходит под влиянием трипсина. [c.356]

Наряду с опытами по ферментативному синтезу полинуклеотидов значительный интерес представляют опыты по ферментативному и химическому расщеплению этих полимеров. В принципе задача этих опытов — изучение порядка чередования нуклеотидов вдоль цепи. В отличие от белков для нуклеиновых кислот вполне удовлетворительных методов пока не существует. Методы ферментативного расщепления дают главным образом статистические данные, однако и такие данные полезны. [c.245]

Ферментативное расщепление нуклеиновых кислот особенно хорошо зарекомендовало себя при исследовании структуры этих высокомолекулярных природных продуктов. [c.441]

Нуклеотиды. могут находиться в клетке и в свободном состоянии как продукты биосинтеза или ферментативного расщепления нуклеиновых кислот. [c.552]

Было описано двухмерное разделение олигонуклеотидов, полученных при ферментативном расщеплении нуклеиновых кислот [297]. Первое разделение проводили в 8%-ном или 10%-ном геле (в зависимости от молекулярных масс разделяемых фраг- [c.379]

Хотя на данном этапе методы химического гидролиза не позволяют сделать выбора между 3 —5 - и 2 —5 -межнуклеотидными связями, доказательства, по-видимому, исключительного присутствия 3 —5 -структуры были получены на основании исследований ферментативного гидролиза рибонуклеиновых кислот и простых нуклеотидных производных. Из различных источников был выделен ряд нуклеаз, которые катализируют гидролиз нуклеиновых кислот на более мелкие фрагменты. Панкреатическая рибонуклеаза [93] — один из группы ферментов, обнаруживающих высокую специфичность к рибонуклеиновым кислотам,— была тщательно изучена и дано объяснение механизма ее действия. Ранние исследования показали, что фермент действует по пиримидиннуклеозидным звеньям, так как крупные педиализуемые остатки после ферментативного расщепления рибонуклеиновой кислоты значительно обогащены пуринами [94] кроме того, выделяются пиримидиновые мононуклеотиды, но не обнаружено свободных пуриновых мононуклеотидов [75, 95, 96]. Дальнейшие исследования кислотного или щелочного гидролиза продуктов, полученных в результате последовательной обработки рибонуклеиновой кислоты рибонуклеазой и фосфомоноэстеразой предстательной железы, привели к заключению, что специфичность рибонуклеазы такова, что нуклеиновые кислоты расщепляются ею с образованием смеси пиримидиновых мононуклеотидов и пуриновых олигонуклеотидов, содержащих в качестве концевой единицы пиримидиновый нуклео-зид-2 (или 3 )-фосфат [75, 97]. [c.377]

Реакции, приводящие к расщеплению фосфоэфирных (в особенности фосфодиэфирных) связей, занимают особое место в ряду других химических превращений нуклеиновых кислот и их компонентов. Они являются основой аналитических методов, используемых для определения состава и строения нуклеиновых кислот. Хотя в настоящее время химические методы гидролиза фосфоэфирных связей в значительной степени уступили место ферментативным, позволяющим проводить такое расщепление в более мягких условиях и более специфично, тем не менее возможности химических способов гидролиза еще далеко не исчерпаны. [c.541]

Для выделения используют небольшие объемы ночных культур. Методика включает ферментативную обработку агробактерий с последующим удалением белков из экстракта смесью фенол/хлороформ и концентрирование нуклеиновых кислот путем осаждения этанолом. Описанная ниже методика успешно использовалась для ряда штаммов агробактерий. В следующем разделе 1.12 представлены результаты расщепления суммарной ДНК, агробактерий ферментами рестрикции и примеры анализа по Саузерну последовательностей плазмид, содержащихся в различных мини-препаратах тотальной нуклеиновой кислоты агробактерий. [c.76]

Все расширяющиеся, все более разнообразные способы медицинского применения ферментов, их кофакторов, их ингибиторов стимулируют развитие соответствующих областей медицинской промышленности. Новые возможности, которые открывает использование ферментативных процессов при обработке сырья биологического происхождения — расщепление белков, нуклеиновых кислот, углеводов, очистка и выделение из сырья необходимых компонентов, использование продуктов распада и т. п. могут быть весьма ценными при производстве медицинских препаратов, разнообразных бактериологических сред, витаминов, антибиотиков или лекарственных веществ эндокринного действия. [c.310]

Нуклеозиды могут быть получены как ферментативным, так и химическим путем из любого встречающегося в природе нуклеотидного материала. Однако главным источником получения этих гли-козидов служат нуклеиновые кислоты, выделяемые из различных тканей и организмов. Расщепление рибонуклеиновой кислоты до смеси входящих в ее состав нуклеозидов может быть достигнуто различными способами, среди которых следует упомянуть гидролиз разбавленным раствором аммиака при повышенной температуре [2], кипячение в течение нескольких дней с водным пиридином [31 и гидролиз, катализируемый ионами различных металлов [4]. Предложенный недавно метод [51 основан на кипячении рибонуклеиновой кислоты (или мононуклеотида) с водным раствором форм-амида в течение нескольких часов при pH 4. Разделение и выделение нуклеозидов было в значительной степени улучшено благодаря использованию ионообменных методов [6]. [c.12]

Описаны также другие двухмерные системы, позволяющие разделять транспортные РНК и полинуклеотиды, полученные путем ферментативного расщепления высокомолекулярных нуклеиновых кислот [395, 608]. [c.380]

Очевидно, что многие нуклеозиды являются интермедиатами в биосинтезе н расщеплении нуклеотидов и полинуклеотидов. В дополнение к так называемым спонгонуклеозидам (термин, применяемый к модифицированным пуриновым нуклеозидам, полученным из карибской губки ryptotethya rypta), которые являются производными арабинозы, многие антибиотики являются производными нуклеозидов, часто имеющих модифицированные углеводные остатки они будут детально обсуждаться позднее. Нуклеозиды сравнительно легко выделить из химических или ферментативных гидролизатов природных полинуклеотидов условия и практические детали этого процесса можно найти в общих учебниках по нуклеиновым кислотам [2, 7, 24]. Все коммерчески доступные образцы основных нуклеозидов получены этим путем. Для выделения больщих количеств таких нуклеозидов наиболее целесообразно применение относительно грубого фракционирования, основанного на различной растворимости, и методов ионного обмена. Для выделения малых количеств модифицированных нуклеозидов либо из природного источника, либо полученных в результате химического синтеза, пригодны многочисленные более эффективные методы, и они будут обсуждаться отдельно. Наконец, следует помнить, что выделение нуклеозидов часто осуществляют дефосфорилированием нуклеотидов [25], выделение и разделение которых не будет рассматриваться в настоящей главе. [c.72]

Состав продуктов гидролиза нуклеиновых кислот зависит от условий проведения реакции. Нагревание РНК или ДНК при 100X в 70%-ной хлорной кислоте приводит к образованию азотистых оснований [7], тогда как при действии на РНК соляной кислоты образуются пуриновые основания и пиримидиновые нуклеотиды [8], а щелочной гидролиз РНК дает смесь 3 - и 5 -рибонуклеотидов. В случае ферментативного расщепления нуклеиновых кислот состав продуктов определяется типом использованной нуклеазы. Например, РНКаза Тг расщепляет молекулу РНК до З -рибонуклеотидов [10], а при последующем действии фосфодиэстеразы из змеиного яда образуются нуклеозиды [11]. Аналогичным образом последовательная обработка ДНК панкреатической ДНКазой I и фосфодиэстеразой из змеиного яда приводит к образованию 5 -дезоксирибонуклеотидов [c.163]

Близкое к избирательному контрастирование рибонуклеопро-теидов специфичность контрастирования РНК следует проверить в контрольных опытах с химическим или ферментативным расщеплением нуклеиновых кислот Для каждого исследуемого объекта необходимо предварительно подобрать оптимальные условия кислотного или ферментативного гидролиза Хорошая сохранность структуры и быстрое расщепление ДНКазой и РНКазой [c.102]

В технологических процессах медицинской промышленности особое значение имеет, например, возможность избавляться от балластных белков ферментативным расщеплением их. Такой способ применяется в производстве лечебных сывороток и вакцин, для их очистки и концентрации. Ферментативное расщепление балластных белков может быть также использовано при выработке антибиотиков, гормонов, некоторых витаминных препаратов, в будущем — нуклеиновых кислот. Расщепляющее действие ферментов (главным образом протеолитических) необходимо при выработке лечебных гидролизатов белков, некоторых специальных продуктов лечебного питания, аминокислот или их смесей. Оно необходимо и при выработке разнобразных бактериологических сред, используемых для медицинской диагностики, для производства токсинов и анатоксинов, иногда антибиотиков и иных лекарственных средств. Подобное техническое использование ферментов имеет хорошие перспективы в ферментной промышленности. [c.323]

Кроме четырех обычных оснований в ДНК (главным образом в ДНК бактериофагов) найдено шесть так называемых минорных оснований. Еще больше — до 35 минорных оснований (табл. 37.3)—встречается в РНК, главным образом в тРНК. Минорные компоненты можно получить лишь расщеплением природных полимеров, так как они образуются в результате ферментативной модификации уже готовых полинуклеотидов, т. е. в результате модификации на макромолекулярном уровне. Кроме того, в работах по изучению структуры и функций нуклеиновых кислот имеют дело с производными компонентов нуклеиновых кислот, т. е. с нуклеозидами, несущими защитные группы, или с аналогами оснований и нуклеозидов, например с азапиримидинами [14]. Разделение таких соединений также было предметом исследования в работе [15]. [c.37]

Макромолекулы, такие, как белки, полисахариды и нуклеиновые кислоты, внутри своих индивидуальных групп отличаются по физико-химическим свойствам лишь незначительно поэтому их выделение, основанное на различиях в этих свойствах, например, с помошью ионообменной хроматографии, гель-фильтрации или электрофореза сопряжено с известными трудностями и требует много времени. Вследствие этого в ходе выделения существенно падает их активность из-за денатурации, расщепления, ферментативного гидролиза и т. п. Одним из наиболее характерных свойств этих биологических макромолекул является их способность обратимо связывать другие вещества. Например, ферменты образуют комплексы с субстратами или ингибиторами, антитела— с антигенами (против которых получены), а нуклеиновые кислоты, такие, как информационная РНК, гибридизуются с комплементарными ДНК и т. д. Образование специфических диссоциирующих комплексов биологических макромолекул служит основой метода их очистки, известного как аффинная хроматография. [c.9]

Необходимо упомянуть еще один частный случай, встречающийся в ферментативной кинетике. При измерении скорости расщепления нескольких связей в молекуле полимерного субстрата (например, белка, полисахарида, нуклеиновых кислот и т. п.), концентрацию субстрата следует выражать в гэквивалентах (число гмолей субстрата, деленное на число затронутых связей) яа литр. [c.9]

Первые работы в СССР в области химии РНК и ДНК выполнены в Московском университете А. П. Белозерским, определившим нуклеотидный состав ДПК различных организмов. В лаборатории А. А. Баева в Институте молекулярной биологии АН СССР разработаны методы выделения индивидуальных т-РНК, расщепления их молекул и разделения полученных олигонуклеотидов установлено их строение. Дальнейшие ра боты но химии РНК, главным образом по онределеиию структуры РНК, модификации нуклеиновых кислот и выяснению зависимости функций РНК от структуры, проводились наряду с этим институтом также в Институте органической химии АН СССР в Новосибирске (Д. Г. Кнорре). В Институте биоорганических соединений АН СССР М. Н. Колосов с сотр. ведет исследования но изучению структуры и функций ДНК, синтезу функционально активных участков ДНК и химико-ферментативному синтезу нуклеотидов [90, с. 43]. [c.107]

Реакции гидролиза фосфомоноэфирных связей, хорошо изученные для разнообразных моноэфиров фосфорной, кислоты, в том числе и природных , в ряду производных нуклеиновых кислот исследованы относительно мало. Это связано прежде всего с тем, что существуют хорошо разработанные методы ферментативного дефосфорилирования мононуклеотидов и концевых нуклеотидных звеньев в олиго- и полинуклеотидах, в то время как химические методы расщепления фосфомоноэфирных связей в рассматриваемых соединениях далеки от совершенства. [c.542]

Л— катализируемый полимеразой синтез ДНК из 5 -дезоксинуклеотидов 5 —ферментативное расщепление той же цепочки нуклеиновой кислоты (с помощью ДНК-азы микрококка и диэстеразы из селезенки), дающее З -дезоксинуклеотиды. [c.333]

Методы, используемые для экстракции рибонуклеиновых кислот, частично зависят от природы органа или организма. В одном из ранних методов, использованном Левиным 11], к густому тесту из дрожжей добавляли щелочь, смесь перемешивали с пикриновой кислотой, фильтровали и нуклеиновую кислоту осаждали из фильтрата добавлением соляной кислоты. Такая довольно жесткая обработка приводила к тому, что полученная нуклеиновая кислота значительно отличалась от нативной рибонуклеиновой кислоты. Для выделения рибонуклеиновых кислот, приближающихся по структуре к нуклеиновым кислотам живой клетки, необходимо избегать применения жестких условий (pH, тедтература) в то же время необходимо, насколько возможно, затормозить ферментативный распад. Широко применялась экстракция рибонуклеопротеидов изотоническим раствором хлористого натрия [2,3]. Белки от нуклеиновых кислот могут быть отщеплены различными методами, такими, как обработка смесями хлороформа с октиловым спиртом [4], додецилсульфатом натрия [5], нитратом стронция [6] или спиртом [7], а также расщепление белковой фракции трипсином [8]. И снова эффективность каждого метода определяется природой рибонуклеопротеида. Для инактивации ферментов в процессе экстракции полезно применение хлоргидрата гуанидина (денатурирующего агента) [9] для выделения рибонуклеиновых кислот и нативных рибонуклеопротеидов из дрожжей был применен метод. [c.364]

В табл. 1 указаны основные нуклеозиды, которые могут быть нолучены из нуклеиновых кислот нри помощи ферментативного расщепления. [c.43]

При разделении субклеточных компонентов мы сталкиваемся с двумя основными затруднениями. Первое из них связано с возможностью возникновения артефактов. В процессе разделения могут образоваться структуры, которых не было в исходной клетке. К артефактам относится, например, расщепление индивидуальных клеточных компонентов на субъединицы, утрата биологической активности субклеточными компонентами (в результате ферментативной шш иной деградации) в процессе выделения, неспецифическое связывание белков с нуклеиновыми кислотами и т. д. Хотя нет единого и притом надежного способа избежать артефактов, но в общеммы можем сказать, что при соблюдении определенных условий вероятность появления артефактов можно свести к минимуму. Условия эти следующие быстрота проведения всех операций по фракционированию, работа на холоду, применение наиболее мягких спо- [c.11]

Химическая характеристика высокомолекулярных соединений путем исследования продуктов деструкции основывается на особенностях строения полимеров. В некоторых случаях продукты распада определенного строения получаются уже при сухой перегонке, для многих полимеров деструкция протекает вплоть до образования мономеров. При облучении ультрафиолетовыми лучами и при размоле в шаровой мельнице также происходит деструкция полимеров, но большей частью только до низкомолекулярных полимеров (например, при размоле полистирола в шаровой мельнице происходит деструкция до степени полимеризации около 100). Направленная деструкция, сопровождающаяся разрывом определенных связей в макромолекуле, позволяет сделать конкретные выводы о строении полимера. Такая реакция имеет место при расщеплении озонидов каучука (см. стр. 81), а также при гидролитическом расщеплении полисахаридов (см. стр. 86, 87 и 91) и идентификации осколков макромолекул известными методами, используемыми для низкомолекулярных соединений. Исследования продуктов распада белков и нуклеиновых кислот также дали возможность сделать предварительные выводы о их строении и о строении структурных единиц (об анализе аминокислот см. стр. 97). О специфических методах ферментативного расщепления было уже упомянуто выше (см. стр. 92). Для установления строения поливинилового спирта, полученного из поливинилацетата, наряду с отсутствием янтарной кислоты в продуктах разложения (как показали Штаудингер и Штарк, см. стр. 107) решающим явился тот факт, что этот полимер не деструктируется или очень незначительно деструктируется такими реагентами, как йодная кислота, расщепляющая 1,2-гликоли (Мар-вел и Деноон). [c.182]

Собственно хроматографическому анализу предшествует расш,епление нуклеиновых кислот, которое можно проводить химическим пли ферментативным путем. Продуктами расщепления являются а) пуриновые и пиримидиновые основания, б) мононуклеотиды, в) пуклеозиды. [c.508]

Метод хроматографии на бумаге позволил получить новые данные по химии нуклеиновых кислот, и с его помощью было изучено строение последних. В этом смысле дапньп метод стал таким же ценным, как и электрофорез на бумаге и хроматография на ионообменных смолах. Полученные за последнее время данные свидетельствуют не в пользу тетрануклеотидной гипотезы. Из нуклеиновой кислоты ферментативным расщеплением были получены полинуклеотиды (от ди- до тетра-), которые после хроматографирования давали характерные пятна на бумаге и после элюирования могли быть подвергнуты более глубокому расщеплению вплоть до мононуклеотидов. Применение метода фракционирования в сочетании с методами хро--матографии и ионофореза па бумаге позволило с помощью специфических ферментов объяснить, какпм образом связаны в полпнуклеотидах компоненты, составляющие их остюву. [c.518]

Концевая избыточность ДНК Т-четных фагов значительно облегчила изучение родственных уз , а также структурных особенностей разнообразных фаговых нуклеиновых кислот. Как было отмечено ранее, экзонуклеаза III из Е. oli катализирует последовательное расщепление ДНК, начиная с З -конца каждой цепи двойной спирали. В результате образуются отрезки, содержащие 5 -конец. При наличии концевой избыточности на обоих концах двухцепочечной молекулы должны иметься одинаковые последовательности. Тогда ферментативное воздействие приведет к образованию комплементарных одноцепочечных отрезков или липких концов, способных сплавляться друг с другом, образуя кольца. Эта реакция, следовательно, может быть использована в качестве теста на концевую избыточность. При электронно-микроскопическом или седиментационном анализе такого материала были обнаружены многочисленные кольцевые молекулы, что убедительно продемонстрировало существование кольцевой избыточности (фиг. 29, А — С) [304]. [c.126]

Общая картина белково-нуклеиновой организации рибосом сильно отличается от таковой для вирусов. Для нее характерно наличие множества контактов между белками и нуклеиновыми кислотами, причем эти контакты, по-видимому, являются очень тесными. Например, многие рибосомные белки связываются с определенными участками рибосомных РНК (рРНК), защищая их от ферментативного расщепления. Имеют место и коопе- [c.211]

Исследование различных химических соединений показало, что далеко не все вещества являются флуо-ресцентами. В частности, представляющие особенный биологический интерес высокомолекулярные соединения — гликоген, белки, нуклеиновые кислоты — не флуоресцируют как целые молекулы. Их элементы, особенно ясно это показано для нуклеиновой кислоты, обладают, однако, способностью к сенсибилизированной флуоресценции. При прибавлении фермента фосфата-зы (кашица печени) к раствору дезоксирибонуклеиновой кислоты от крупного органического ядра отщепляется входящий с ним в эфирную связь радикал фосфорной кислоты — РО . При этом возникает излучение, характеризующееся определенным спектром. Идентичный спектр получается и при ферментативном расщеплении лецитина, также заключающего радикал фосфата в эфирной связи. Одно это уже показывает, что излучение как-то связано с свободным радикалом фосфата, [c.11]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология