Гели обработка после электрофорез

На электроды 8 к 9 подают разность потенциалов, необходимую для проведения электрофореза в поддерживающей среде — носителе, в качестве которого можно использовать различные гели. После электрофореза обечайку 1, выполненную из отдельных секторов, разбирают и извлекают из аппарата электрофореграммы, которые подвергают обработке. [c.67]

Анализ гелей после извлечения их из трубок. Извлеченные из трубок гели можно сканировать, не подвергая их никакой дальнейшей обработке или после окрашивания. Окрашенные гели можно также разрезать на сегменты и проанализировать материал, полученный путем элюирования. Кроме того, гели можно солюбилизировать, например для определения в них радиоактивности. Гели извлекают из трубок и окрашивают сразу же после электрофореза во избежание диффузии полос. Извлечение гелей связано с трудностями, и для того, чтобы успешно провести эту процедуру, не повредив поверхности гелей, необходим определенный опыт. Один из возможных способов заключается в том, что в пространство между стенкой трубки и гелем медленно вводят вращательным движением иглу шприца длиной около 8 см, выдавливая из шприца воду или 50%-ный глицерин. Иглу вынимают после того, как гель начинает свободно перемещаться в трубке или когда его можно вытеснить под давлением с помощью медицинской капельницы с грушей, заполненной водой. Это следует делать над лотком с водой или в самом лотке. [c.268]

ОБРАБОТКА ГЕЛЕЙ ПОСЛЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА [c.72]

Описаны приемы локализации протеолитической активности после электрофореза в крахмальном [655, 1120] и полиакриламидном гелях [57] с использованием методики включения субстрата в гель. Возможность применения этой методики для указанной цели была недавно изучена [37]. Чтобы предотвратить миграцию белкового субстрата вовремя электрофореза, эти авторы использовали в качестве субстрата казеин, осажденный кислотой. Нерастворимый казеин обрабатывали ультразвуком и образовавшиеся мельчайшие частицы смешивали с гелеобразующим раствором. Конечная концентрация казеина в геле составляла 0,1% (масса/объем). После электрофореза гель инкубировали в течение 2—12 ч при 37°С в 0,1 М буфере трис-НС1 (pH 7,5). Казеин пригоден только при электрофорезе в кислой среде, поскольку в щелочной среде он мигрирует. В этом случае вместо казеина можно использовать препарат гемоглобина, приготовленный путем осаждения и обработки ультразвуком. Окрашивание гелей белковым красителем (напри-, мер, нигрозином) увеличивало контрастность полос. [c.303]

Неиспользованные после посадки F(a )j диазогруппы бумаги блокировали обработкой глицином и бычьим сывороточным альбумином. Когда после электрофореза белки из геля описанным выше приемом блоттинга переносили на диазобумагу, они уже не встречали свободных диазогрупп. Большинство из них, не задержавшись на бумаге, следовало дальше в лежащие сверху фильтры. Только антигены для закрепленных на диазобумаге [c.132]

Во всех описанных способах белки перед окрашиванием или в его процессе фиксируют осаждением кислотой и спиртом. Однако некоторые основные белки (например, рибонуклеаза и протамин), а также низкомолекулярные пептиды и гормоны при такой обработке не осаждаются, а, наоборот, растворяются и вымываются из геля. Недавно был предложен принципиально иной подход к фиксации белков и пептидов в геле после электрофореза. Гель в течение 1 ч вымачивают в 5%-ном растворе формальдегида в 25%-НОМ этаноле с добавлением СВВ R-250 до 0,11%. В этих условиях формальдегид ковалентно сшивает пептиды с матрицей геля за счет образования метиленовых мостиков между аминогруппами аминокислот и первичными аминами ПААГ. На приведенных в работе фотографиях можно видеть разительный эффект обнаружения щелочных и низкомолекулярных белков гели, кажущиеся пустыми при обычном окрашивании, на самом деле содержат множество белковых полос. Гели с ДДС-Na красят более продолжительное время (до 3 ч) в 3,5%-ном рас- [c.93]

Обработка агаровых пластинок. После окончания электрофореза ток выключают, предметные стекла с агаровым гелем тотчас извлекают из камеры и помещают на 30 мин в 5%-ный раствор СНзСООН. Каждую пластинку покрывают листочком фильтровальной бумаги, смоченным в 5%-ном растворе СНзСООН, для удаления воды и солей и высушивают при комнатной температуре в течение ночи. Для ускорения высушивания его проводят при температуре 37 °С или под струей теплого воздуха. Бумагу, приставшую к агаровой пленке, осторожно снимают, предварительно смочив ее водой. Перед окрашиванием агаровое поле должно быть совершенно сухим и прозрачным. Окрашивание белков на электрофореграммах проводят амидовым черным 10 Б в течение ночи. Не связавшийся с белком краситель отмывают 5%-ным раствором уксусной кислоты. Отмытые электрофореграммы высушивают при 37 °С. [c.93]

Проведение электрофореза. Разделение можно проводить как в трубочках (с. 95), так и на пластинах для вертикального электрофореза (с. 97). После обработки ДСН к образцам добавляют сахарозу (до концентрации 10%) и в качестве лидирующего красителя — бромфеноловый синий (до концентрации 0,001%). Образцы исследуемых белков и белков-маркеров наносят на поверхность геля в объеме от 20 до 100 мкл (каждого или смеси нескольких образцов) и осторожно наслаивают электродный буфер. Нагрузка на гель определяется методом окраски гелей, а также способностью того или иного белка связывать используемый краситель. Как правило, при электрофорезе в трубочках удается обнаружить от 20 до 100 мкг белка, при электрофорезе в пластинке — от 4 до 15 мкг. В электродный буфер катодного отделения добавляют ДСН до концентрации 0,1%. Электрофоретическое разделение проводят при комнатной температуре и силе тока 8 мА на трубочку. При этом сначала устанавливают силу тока - [c.120]

Обработка электрофореграмм. Определяют расстояние, пройденное каждым белком от стартовой линии. Определение можно проводить визуально или с помощью денситометра при 550—600 нм. Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс длину пути 1а, пройденного данным белком, а по оси ординат — логарифм его молекулярной массы. Определив длину пути, пройденного белком с неизвестной молекулярной массой 1х, пользуясь калибровочным графиком, определяют молекулярную массу исследуемого белка. При проведении электрофореза в трубочках часто трудно получить хорошо воспроизводимые результаты на разных трубках. В этом случае определяют не абсолютную, а относительную подвижность белков. Для этого определяют отношение длины пробега белковой зоны либо к общей длине геля, либо к длине пробега лидирующего красителя. После этого строят зависимость относительной подвижности белков от логарифма их молекулярной массы. [c.121]

Адаптация микроорганизмов, как правило, сопровождается продолжительной задержкой их роста, после которой он возобновляется. Культура может достигнуть нормального роста только при условии, что энергия не расходуется на процесс адаптации. Методы адаптации варьируют от обработки биомассы токсинами до тонких изменений в клеточной стенке, цитоплазме, ферментах и геноме микроорганизмов. Такая приспосабливаемость часто вызывает наследуемые изменения в составе белков, которые могут определяться как на клеточном, так и на субклеточном уровне с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. [c.55]

Характер расположения в мембране того или иного белка можно определить несколькими способами. Один из них основан на том, что меченные (флуоресцентными красителями или радиоактивными изотопами) водорастворимые реагенты не способны проникать через мембрану и поэтому ковалентно связываются со специфическими группами только на ее наружной стороне. После этого мембраны растворяют, белки разделяют методом электрофореза в полиакриламидном геле, а меченые белки идентифицируют либо по радиоактивности (радиоавтография гелей), либо по флуоресценции в ультрафиолетовом свете. Используя такое направленное мечение, можно определить, как конкретный белок (полоса в геле) ориентирован в мембране если он метится одновременно и на внешней стороне (вместе с нативными клетками и тенями без разрывов), и на цитоплазматической стороне (вместе с замкнутыми вывернутыми наизнанку пузырьками), то это, несомненно, трансмембранный белок. Альтернативный подход состоит в обработке либо наружной, либо внутренней поверхности мембраны не проникающими через нее протеолитическими ферментами если какой- [c.363]

Обработка гелевых столбиков после электрофореза. Трубочки вынимают из камеры, помещают в пронумерованные пробирки. Гель из них извле- кают с помощью воды, вводимой шприцем с длинной иглой между столбиком геля и стенкой трубочки, при этом гель выскальзывает из трубочки. [c.35]

Первое упоминание о тонких пластиковых листах как о носителях адсорбента в ТСХ относится к 1964 г. [44]. Вскоре после этого готовые для использования хроматографические материалы такого типа начали в большом количестве производиться многими фирмами. Эти листы удобны тем, что легко режутся ножницами, и поэтому из них можно вырезать пластинку любого размера. Однако емкость слоя адсорбента на таком листе обычно несколько меньше, чем на стекле. Такие листы (20X500 см) выпускаются в виде рулонов [45]. Халпаап и Бауш [46] получали на них хроматограммы длиной до 1 м. Рёсслер и сотр. [47] запатентовали метод покрытия пластиковых листов диоксидом титана или циркония перед нанесением адсорбента. Такая обработка препятствует диффузии пластификаторов и других веществ из пластика в адсорбент. Тонкие пластиковые листы рекомендованы в качестве подложки для геля в тонкослойном электрофорезе, позволяющей устранить искажение профиля зоны, происходящее в толстых слоях, и избежать необходимости делать срезы геля. Для этой цели использовалась также покрытая тефлоном стеклянная бумага [40]. [c.41]

После завершения иммунодиффузии иммуноэлектрофорег-рамму можно сразу же сфотографировать без всякой обработки геля, причем лучше в рассеянном свете (при темнопольном освещении [952]). Кроме того, линии преципитации можно окрасить каким-либо белковым красителем. Перед окрашиванием непрореагировавшие белки необходимо отмыть солевым раствором. Для этого пластины геля вымачивают в течение 24—48 ч в солевом растворе, который несколько раз меняют. В последний раз гель промывают дистиллированной водой. Во время промывания слой геля может отделиться от стеклянной пластинки. Чтобы этого не произошло, стеклянную пластинку перед нанесением на нее горячего агарового золя следует покрыть тонкой. пленкой агара (на пластинку наливают разбавленный золь агара и дают ему высохнуть). После промывания гель накрывают полоской влажной фильтровальной бумаги, размеры которой на несколько сантиметров должны превышать размеры геля. Гель вместе с бумагой высушивают под вентилятором, а затем отделяют бумагу от высушенного слоя агара. Линии преципитации можно окрашивать практически любым красителем, применяемым для окрашивания белков после электрофореза в агаровом или агарозном гелях. [c.239]

Окрашивание ПАА-гелей в течение ночи кумасси R250 (0,2% масс./об.) в смеси 45%-ньтй метанол — 10%-ная уксусная кислота, обесцвечивание раствором Ю7о-ный метанол — 7%-ная уксусная кислота [317]. После электрофореза агарозные гели смачивались дистиллированной водой, обертывались фильтровальной бумагой и выдерживались 30 мин при 37 °С. Окраска проявлялась через 15 мин после обработки кумасси R250 (0,1%, масс./об.) в смеси 45%-ный этанол— 10%-ная уксусная кислота. Обесцвечивание той же смесью растворителей. [c.304]

Рис. 5.1. Рестрицированная ДНК из различных источников после электрофореза в агарозном геле и окрашивания бромистым этидием. Дорожка 1 —калибровочные фрагменты ДНК бактериофага X, обработанной Hindlll. 2 — при обработке рестриктазой ДНК плазмиды образуются хорошо различимые фрагменты. 3 — тотальная ДНК агробактерий, обработанная рестриктазой. 4 — тотальная ДНК растения, обработанная рестриктазой.

Недавно был предложен принципиально новый способ окраски белков после электрофореза в ПААГ, обеспечивающий, по утверждению авторов, на два порядка более высокую чувствительность, чем СВВ R-250 [Merril et al., 1979]. Белки окрашивают ионами серебра в присутствии небольшой добавки ионов меди. Эти ионы вносят в составе нитратов серебра и меди, растворенных в воде с добавлением пиридина и этанола. Гель предварительно обрабатывают формальдегидом. После первой обработки этими ионами гель еще раз споласкивают довольно концентрированным (11%) щелочным раствором нитрата серебра и, наконец, восстанавливают серебро обработкой смесью формальдегида и лимонной кислоты в 10%-ном этаноле. Механизм окрашивания неясен. По-видимому, он сходен с восстановлением серебра в фотографическом процессе, так как передержанный гель можно ослабить обычным ослабителем для фотографии. [c.95]

Наиболее широко практикуемый метод определения местоположения веществ после электрофореза на бумаге, ацетате целлюлозьг и в геле — это обработка среды красителем, который избирательно [c.126]

При обработке мембран тилакоидов детергентами можно перевести в раствор те белки, которые обычно тесно связаны с мембранами. Растворенные таким образом компоненты можно разделить по их молекулярным массам, используя, например, электрофорез в полиакриламидном геле. Полосы, соответствующие отдельным белковым компонентам, проявятся после обработки геля специальными красителями. Наряду с этим можно получать мутантов растений и водорослей, не имеющих специфических белков или пигментов хлоропластов и вместе с тем утративших какие-либо характерные функции или фотосинтетическую активность в целом. Сравнивая набор компонентов, обнаруживаемых в геле после электрофореза белков из мутантов и из организмов дикого типа, можно установить зависимость между определенной функцией и тем или иным компонентом, например белком или пигмент-белковым комплексом. Таким образом были разделены и предварительно охарактеризованы связанный с реакционным центром фотосистемы I комплекс Руоо—хлорофилл а—белок связанный с реакционным центром фотосистемы II комплекс светособирающий хлорофилл а/Ь — белок железо-серные белки, связанные с мембраной цитохром / АТРаза, или сопрягающий фактор, и другие компоненты мембран тилакоидов (см. рис. 8. 1). [c.66]

Один из специфических вариантов счета радиоактивности элюата из геля после электрофореза белков в комплексе с ДДС-Na отработан именно для концентрирования белкового препарата. В нем используется способность комплекса белок— ДДС-Na при пониженной температуре и обработке 10%-ным раствором ТХУ образовывать мицеллы, которые сорбируются на нитроцеллюлозных фильтрах типа Millipore НА . К элюату белка в 1 %)-ном растворе ДДС-Na с б М мочевиной добавляют в качестве носителя бычий сьшороточный альбумин до концентрации 0,25 мкг/мл, а затем 2 объема 15%)-ного раствора ТХУ. [c.109]

Фракционирование белков сыворотки крови на КМ-целлюлозе осуществляют с помощью ступенчатого элюирования, подавая на колонку последовательно следующие растворы 0,02 М натрий-ацетатный буфер, pH 4,6 ( стартовый буфер), затем 0,05 М натрий-ацетатный буфер, pH 5,2 0,08 М натрий-ацетатный буфер, pH 6,0 0,1 М фосфатный буфер, pH 7,0 и, наконец, 0,1 М фосфатный буфер, содержащий 0,5 М Na l, pH 8,3. Каждый новый раствор подают на колонку только после того, как полностью элюируется пик, вымываемый предыдущим раствором. Скорость тока приблизительно составляет 50 мл/ч. Элюат собирают порциями по 2—3 мл. Обработку результатов см. на с. 108. Идентификацию белков осуществляют методом электрофореза на бумаге или в полиакриламидном геле (с. 112). Регенерацию КМ-целлюлозы проводят вне колонки. [c.113]

Нанесение фоторезистов. В том виде, в каком фоторезисты получают от поставщика, они содержат различные от партии к партии количества гелей к инородных частиц. Если эти примеси попадают в нанесенный слой фоторезиста, то они в значительной степени ухудшают качество проявленного рисунка. Поэтому в любом случае перед использованием рекомендуется фоторезисты подвергать фильтрации [84—86]. Обычно это осуществляется с помощью фильтров с очень мелкими порами, стойких к воздействию растворигелеи. Материалы такого типа имеются в промышленности. Это найлон, целлюлоза, а также тефлон с размерами пор от 14 до 0,25 мкм. Обычно во избежание засорения, операцию фильтрации проводят в две стадии. На первой стадии на установках сравнительно грубой очистки пол действием силы тяжести или рабочего давления фильтра удаляются 6o ib-шне частицы. После этого проводится тщательная фильтрация под давлением через фильтры тонкой очистки, с размерами пор или отверстий шириной около 1 мкм. Широко применяется метод, в котором фильтры тонкой очистки встраиваются в установки, с помощью которых фоторезисты наносятся на поверхность подложек. Видоизмененный метод очистки, в котором для удаления сферических частиц из фоторезистов типа KMER применен электрофорез, описан Тейлором [87]. Самый эффективный метод очистки был разработан одним из поставщиков интегральных микросхем [78]. Этот метод состоит из двух операций химической обработки — экст-ракции жидкости жидкостью с последующим центрифугированием, Тща- [c.596]

Сиаловые кислоты, входящие в состав гликонротеинов, защищают их от действия протеолитических ферментов, поэтому необходимо предварительно отщепить их нейраминидазой. После удаления сиаловых кислот гликопротеины частично расщепляются протеолитическими ферментами (папаин, проназа) на гликопептиды, доступные для дальнейшего исследования. Гликопептиды затем обрабатывают ферментами, отщепляющими аминокислоты (например, карбоксипептидазой после защиты конечной аминогруппы), и превращают в олигосахариды, содержащие только одну аминокислоту. Углеводные компоненты гликапро-теинов, имеющих щелочелабильную связь углевод—аминокислота, отщепляют щелочной обработкой или ферментами, разрушающими связи такого типа. Полученные таким образом гетеросахариды или гетеросахариды с одной аминокислотой очищают от примесей пептидов и аминокислот переосаждением из водноорганических смесей (вода-спирт, вода—ацетон), экстракцией фенолом, хроматографией, электрофорезом или гель-фильтрацией. [c.76]

В ядрах клеток всех эукариотов ДНК присутствуют в виде ассоциатов с гистоновыми белками. Эти ассоциаты, или хрома-тиновые фибриллы, представляют собой надмолекулярную структуру, повторяющимся элементом которой является частица, называемая нуклеосомой. Каждая нуклеосома состоит из восьми гистонов (по две молекулы гистонов Н2А, Н2В, НЗ и Н4) и включает участок намотанной на этот белковый октамер нити ДНК длиной в 140 нуклеотидных пар. Продолжение этой нити образует перемычку со следующей нуклеосомой. В зависимости от т ого, какому организму или какой ткани этого организма принадлежит данная клетка, перемычка между нуклео-сомами может содержать от О (дрожжи) до 100 (сперма морского ежа) нуклеотидных пар. Стафилококковая нуклеаза расщепляет молекулу ДНК в области перемычек с образованием фрагментов, длина которых кратна длине участка ДНК, входящего в состав нуклеосомы [136]. После отделения от белков эти фрагменты можно разделить с помощью электрофореза в агарозном геле и таким образом обнаружить различия в структуре повторяющегося звена хроматина (рис. 10.13, Л). При обработке хроматина ДНКазой I нуклеосомальная ДНК расщепляется на фрагменты, содержащие в среднем 10,4 нуклеотидных пар (я —целое число) [137]. Эти сравнительно более короткие фрагменты ДНК можно разделить с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (рис. 10.13, ). [c.193]

Местоположение подвергшихся гидролизу связей определяют, вводя метку в одну из цепей ДНК, причем только в один ее конец. Как показано на рис. 11.4, фрагменты ДНК, полученные после нуклеазной обработки, разделяют по размеру при помощи электрофореза в геле. (Принцип, лежащий в основе частичного расщепления каждого гидролизуемого участка с последующим выделением меченных по концу фрагментов, тот же самый, который был использован при определении последовательности ДНК см. рис. 3.4.) Каждой гидролизованной связи на геле соответствует полоса, подвижность которой определяется расстоянием от меченого конца до места разрыва. В участке, защищенном от гидролиза РНК-полимеразой, разрывов не происходит и соответствующие полосы на геле отсутствуют. Каждая из двух цепей ДНК, меченных радиоактивным изотопом, может быть проанализирована по отдельности. Сравнивая полученные отпечатки с результатами определения последовательности ДНК, устанавливают нуклеотидную последовательность участка связывания и его местоположение. [c.141]

Принципы и техника электрофореза не требуют специального описания [14—16]. Обнаружение одиночного пика при двух или трех достаточно далеких значениях pH является признаком гомогенности. Применение для этой цели интерференционной онтики менее удовлетворительно, несмотря на ее высокую чувствительность, поскольку полученная кривая требует дифференцирования. Электрофоретическая подвижность зависит как от заряда молекулы, так и от гидродинамического сопротивления, причем оба эти фактора независимы. Они могут компенсироваться, давая в результате одинаковую подвижность для двух физически совершенно различных молекул, по это не может происходить при различных значениях pH. Поэтому важно проверить устойчивость гликопротеина в изучаемом интервале pH многие гликонротеины неустойчивы, особенно при высоких pH [17—19]. Полезная дополнительная информация может быть получена, если гликопротеин содержит заметные количества концевой сиаловой кислоты. В таких случаях заряд молекулы онределяется главным образом этим компонентом, и в большинстве случаев сиаловую кислоту можно почти полностью удалить с помош ью нейраминидазы. Если используемое количество фермента таково, что его можно обнаружить при последуюш,ем электрофоретическом анализе, фермент лучше сначала удалить, если это можно сделать удобным способом. Часто для этого пригодна гель-фильтрация. Молекулярный вес нейраминидазы холерного вибриона составляет около 9 -10 (Лэйвер [20]). Если после обработки нейраминидазой наблюдается два или более электрофоретически различных компонента вместо одного, наблюдавшегося перед обработкой, это значит, что материал, несмотря на его электрофоретическую гомогенность, содержит молекулы, различающиеся по химической природе остатков, от которых зависит заряд молекулы. Эта процедура может повысить степень полидисперсности, если реакция пе доведена до конца, но она не будет превращать гомогенные препараты в гетерогенные. Очевидно, важно убедиться, что используемая нейраминидаза не обладает никакой иной ферментативной активностью, особенно протеолитической. Описаны методы получения нейраминидазы необходимой чистоты [21, 22]. Проверке по этому способу был подвергнут а1-кислый гликопротеин человека [23], после обработки нейраминидазой наблюдалось два электрофоретических ника, несмотря на кажущуюся гомогенность необработанного материала в широком интервале рЬ1. [c.45]

Фракцию а-казеина, которая была получена в виде нерастворимой кальциевой соли, Вог [43, 44] назвал g-казеином, Макмикин и сотр. [45] — ai-казеином и Лонг и сотр. [46]—аг-казеином. а-Казеин содержит два основных компонента с оптической плотностью, равной 45% оптической плотности казеина, полученного после первого этапа его обработки с использованием хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе в присутствии 4,5 М мочевины. Эти компоненты взаимодействуют с >с-казеином (см. ниже) в соответствующих весовых соотношениях, образуя комплексы в отсутствие двувалентных катионов, или мицеллы, способные образовывать комки с реннином в присутствии двувалентных катионов. С помощью электрофореза на крахмальном геле было показано, что обе главные фракции гетерогенны [47]. Первая элюированная фракция названа agi, 2-казеином она является смесью si- и ад2-казеинов, причем asi-казеин обладает большей подвижностью при pH 8,4 вторая фракция была названа ад-казеином. [c.42]

С помощью электрофореза на крахмальном геле было показано, что 15 из известных 16 генетических вариантов трансферрина человека (см. ниже) разлагаются под действием нейраминидазы на четыре дополнительных медленно движущихся компонента, которые образуются ступенчато. Присутствие и относительная интенсивность окрашивания этих компонентов зависят от концентрации фермента (рис. 1 [25, 56]). Опыты по электрофорезу очищенного трансферрина в крахмальном блоке показывают (рис. 2), что происходит постепенное отщепление сиаловой кислоты от молекулы трансферрина. Каждый из четырех остатков сиаловой кислоты в молекуле трансферрина обусловливает определенное повышение электрофоретической подвижности цельной молекулы белка. По мере гидролиза кетозидных связей ферментом увеличивается количество отщепленной сиаловой кислоты. Этот процесс происходит до тех пор, пока все четыре остатка не будут удалены. После этого дальнейшее увеличение электрофоретической подвижности уже не обнаруживается. Полоса 4 (рис. 1) представляет собой необработанный трансферрин, в молекуле которого содержится полный комплект из четырех остатков сиаловой кислоты. Полосу О дают молекулы, из которых полностью удалены остатки сиаловой кислоты, полосы 1—3 — молекулы, содержащие соответственно от 1 до 3 остатков сиаловой кислоты. Обработка ферментом не влияет на способность трансферрина связывать железо, на его иммунологические свойства, а также на поведение при ультрацентрифугировании. Огупенчатое расщепление трансферрина, сходное с наблюдающимся при расщеплении нейраминидазой, обнаружил Поулик [57, 58] при обработке трансферрина дифтерийным токсином. Блюмберг и Уоррен [59] сообщили, что после обработки нейраминидазой одна полоса, соответствующая трансферрину, разделяется на две полосы равной интенсивности. Это явление наблюдается в том случае, если из молекулы трансферрина удаляется около 90% сиаловой кислоты. [c.123]

Атропинэстераза сыворотки кролика — неснецифический В-тип эсте-разы, является гликопротеином, содержащим сиаловую кислоту. Обработка нейраминидазой приводит к уменьшению общего отрицательного заряда молекулы белка фермента, что было показано с помощью электрофореза на крахмальном геле при pH 4,5. После отщепления сиаловой кислоты каталитические и антигенные свойства молекулы фермента в основном сохранялись [83]. [c.246]

Смит и др. [152] исследовали три обычных подтипа гаптоглобина с целью определения N-концевых групп. Во всех случаях были идентифицированы валин и изолейцин, что указывает на присутствие в молекуле гаптоглобина двух полипептидных цепей. После восстановительного расщепления гаптоглобина с помощью меркаптоэтапола в мочевине [150, 151] было установлено, что одна из полипептидных цепей, изолейцил- или -цепь, идентична во всех подтипах гаптоглобина, а валил- или а-цепи различны по свойствам при электрофорезе на различных системах крахмального геля. Аминокислотный анализ и исследование пептидов, полученных в результате обработки гаптоглобина химотрипсином [151], показали, что наблюдаемые различия частично могут быть обусловлены замещением аминокислот. [c.252]

После обработки РНКазой защищенные фрагменты разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидных гелях в присутствии мочевины и визуализируют путем радиоавтогра- [c.31]

Рис. 36.5. Блоттинг-перенос. По методу Саузерна тотальную ДНК, выделенную из культуры клеток или ткани, обрабатывают одной или несколькими рестриктазами и полученную смесь фрагментов подвергают электрофорезу в агарозном или полиакриламидном геле. ДНК, несущая отрицательный заряд, мигрирует к аноду. Небольшие фрагменты двигаются быстрее крупных. После окончания электрофореза разделенные фрагменты ДНК подвергают мягкой денатурации, инкубируя гель в растворе щелочи. На следующем этапе гель накладывают на нитроцеллюлозный фильтр. Фрагменты ДНК переносят на нитроцеллюлозу с помощью методических приемов, разработанных Саузерном, и фиксируют полученную нитроцеллюлозную реплику тепловой обработкой. Далее реплику инкубируют с меченым кДНК-зондом, гибридизую-щимся с соответствующим комплементарным фрагментом ДНК на нитроцеллюлозном фильтре. После интенсивной промывки фильтр помещают на рентгеновскую пленку. Фиксируемые на радиоавтографе сигналы соответствуют расположению фрагментов ДНК, комплементарных последовательности зонда. Метод Нозерн-блот (для анализа РНК) принципиально не отличается от метода переноса по Саузерну (Саузерн-блог анализа). Тотальную РНК подвергают электрофорезу. Сама процедура переноса РНК из геля на фильтр несколько отличается от метода Саузерна, поскольку молекулы РНК менее стабильны, чем молекулы ДНК. Метод Вестерн-блот применяется для выявления определенных белков с помощью

Справочник химика 21

Химия и химическая технология