Окрашивание гелей

После 30 мин окрашивания гель несколько минут промывают водопроводной водой, помещают сначала на 24 ч в первый дифференцирующий раствор, а затем во второй до полного обесцвечивания тех частей, которые не содержат белка. [c.88]

Короткие фрагменты в агарозном геле мигрируют намного быстрее, чем длинные, при этом подвижность фрагментов ДНК в геле обратно пропорциональна логарифму массы (заряда) этого фрагмента. При окрашивании гелей красителями (например, бромистым этидием), связывающимися с ДНК, выявляется набор полос, каждая из которых отвечает ре- [c.27]

Рис. 9.6. Электрофоретический анализ ре- -стрикционных фрагментов ДНК. ДНК фага X инкубировали с различными указанными на рисунке рестриктазами время, достаточное Для того, чтобы во всех чувствительных сайтах произошло расщепление нуклеотидной последовательности. Образовавшуюся смесь фрагментов ДНК подвергали электрофорезу в агарозном геле. Полосы идентифицировали в ультрафиолетовом свете после окрашивания геля бромистым этидием. Стартовые точки обозначены жирными стрелками. Интактная ДНК фага X представляет собой линейную молекулу длиной около 48 500 н. п. При действии рестриктазы ВдШ возникают фрагменты длиной 22800,

Обесцвечивание. При окрашивании гелей по описанной выше методике фон остается прозрачным и не требует обесцвечивания. Однако во многих случаях после окрашивания необходимо проводить обесцвечивание фона. Это можно делать либо с помощью электрофореза, либо путем выщелачивания избытка красителя. Электрофоретическое обесцвечивание возможно в том случае, если краситель прочно связывается с белком, иначе некоторые полосы могут исчезнуть. Кроме того, для этих целей необходимо специальное приспособление. Тем не менее этот способ отличается быстротой и дает более светлый фон. [c.269]

Швабе 1[1151] разработал простое устройство для поперечного электрофоретического обесцвечивания цилиндрических гелей. Анодное и катодное пространства разделены между собой вертикальной перегородкой, в которой сверху вниз прорезаны сквозные пазы. Гели плотно вставляют в эти пазы таким образом, что электродные камеры, заполненные 5%-ной уксусной кислотой, оказываются герметично отделенными друг от друга. Обесцвечивание занимает 6 мин. Как уже отмечалось выше, этот аппарат был использован и для электрофоретического окрашивания гелей [1151]. Таким образом, обе операции — окрашивание и обесцвечивание—можно выполнить за несколька минут. [c.189]

В некоторых случаях всем остальным белковым красителям следует предпочесть нигрозин (С. I. 50420). Ли [751] показал, что в полиакриламидных гелях глютеновые белки окрашиваются водорастворимым нигрозином лучше, чем амидовым черным. Для окрашивания гели выдерживают 3 ч в смеси метанол — вода — уксусная кислота (4 5 1 по объему), содержащей 0,0125% нигрозина, а затем обесцвечивают в той же смеси растворителей. Гели можно хранить в 5%-ной уксусной кислоте. Найдено, что нигрозин имеет ряд преимуществ при окрашивании белков эндосперма пшеницы [250], а также белков, преципитирующих в иммунологических реакциях. [c.272]

Описаны приемы локализации протеолитической активности после электрофореза в крахмальном [655, 1120] и полиакриламидном гелях [57] с использованием методики включения субстрата в гель. Возможность применения этой методики для указанной цели была недавно изучена [37]. Чтобы предотвратить миграцию белкового субстрата вовремя электрофореза, эти авторы использовали в качестве субстрата казеин, осажденный кислотой. Нерастворимый казеин обрабатывали ультразвуком и образовавшиеся мельчайшие частицы смешивали с гелеобразующим раствором. Конечная концентрация казеина в геле составляла 0,1% (масса/объем). После электрофореза гель инкубировали в течение 2—12 ч при 37°С в 0,1 М буфере трис-НС1 (pH 7,5). Казеин пригоден только при электрофорезе в кислой среде, поскольку в щелочной среде он мигрирует. В этом случае вместо казеина можно использовать препарат гемоглобина, приготовленный путем осаждения и обработки ультразвуком. Окрашивание гелей белковым красителем (напри-, мер, нигрозином) увеличивало контрастность полос. [c.303]

Для окрашивания гелей применяют также реагенты общего типа кумасси голубой [14], комплексы серебра [47, 48, 52] или более специфичные, например для идентификации гликопептидов [17, 28, 69] — реагент Шиффа [32], модифицированный вариант окрашивания комплексами серебра [16], лектины, содержащие радиоактивную [39] или флуоресцентную метку [23] (см. также гл. 8). [c.229]

IV. Заливка гелей. Различные наборы для приготовления гелей включают пары стеклянных пластин, тефлоновые гребенки для формирования карманов в концентрирующем геле, прокладки для достижения требуемой толщины геля, форму и платформу для заливки геля, зажимы, прибор для вертикального электрофореза, источник питания,, кюветы для отмывания и окрашивания гелей, приспособления для высушивания гелей и др. Поставщики оборудования— см приложение. [c.58]

Самый простой путь определения концентрации моноклональных иммуноглобулинов в асцитных жидкостях — электрофорез с последующим окрашиванием гелей. На электрофоре-грамме должны быть видны отдельные полосы, характеризующиеся определенным положением в случае антител данной специфичности. Их интенсивность можно сравнить с интенсивностью полос, полученных при исследовании проб, отобранных на более ранних пассажах. Данный метод более удобен и информативен, чем титрование специфических антител, хотя время от времени следует применять и последний. [c.148]

Мы получали удовлетворительные результаты при окрашивании гелей серебром, однако там, где это возможно, мы предпочитаем применять биосинтетическое мечение. Относительно небольшие изменения количества образцов, наносимых на гель для двумерного разделения, могут быть причиной получения столь различных картин фракционирования, что их трудно сравнивать. В случае радиоавтографии (или флюорографии) разницу в картинах распределения пятен в двух гелях, различающихся на порядок по количеству нанесенного материала, можно компенсировать подбором соответствующего времени экспозиции. [c.214]

После электрофореза можно хранить гель на том же стекле, обернув его целлофаном, или предварительно перенести на металлическую фольгу. Можно положить на гель фильтровальную бумагу, которая хорошо к нему прилипает, и снять стекло. На этой же бумаге (после фиксации и окрашивания) гель можно и высушить. [c.35]

Использование цетавлона имеет и свои трудности. При взаимодействии с персульфатом аммония он довольно легко выпадает в осадок, поэтому полимеризацию геля приходится вести при слегка повышенной температуре (37°), в термостате. Кроме то-гр, цетавлон осаждает красители типа СВВ R-250, поэтому окрашивание геля ведут при температуре 80—100°. [c.85]

Для опыта в геле требуется обычно 10 мкг белка. Это количество может быть еще более снижено, если окрашивание геля вести длительное время. Для нахождения связи между электрофоретической подвижностью и молекулярными весами различных белков используют два способа либо несколько белков, денатурированных натрийдодецилсульфатом, смешивают и наносят вместе на один гель, либо белки под-вергают электрофорезу одновременно, но на разных гелях. Оба способа дают идентичные результаты. [c.420]

Вискозную губку 5, расположенную на анодной пластине 6, тщательно насыщают 70%-ной уксусной кислотой. На верхней стороне губки расположен гребнеобразный сепаратор 4, в который вставляют столбики геля. Поверх образцов геля помещают другую вискозную губку и накрывают ее целлофанавой пленкой, на которую ставят катодную пластину. Все эти слои скрепляют тонкими резинками проделать это следует очень осторожно, так как иначе можно выжать жидкость из губки. Чтобы прибор работал нормально, столбики геля должны контактировать с источником питания с двух сторон при этом они не должны выступать из блока. Блок помещают в чашку Петри (катодом кверху). Для одного столбика геля достаточно напряжения 25— 50В при силе тока 25—30 мА. Через 25—40 мин работы прибор выключают, разъединяют и столбики геля вставляют в пробирки с 7%-ной уксусной кислотой. Используемая вискозная губка должна быть мелкопористой и однородной. Если плотность тока увеличивается или обесцвечивание проводится слишком долго, может происходить частичное высушивание или окрашивание геля. Если данная вискозная губка всегда помещается у одного и того же электрода, ее не нужно отмывать после процесса обесцвечивания, а достаточно просто выжать. [c.309]

С использованием полинуклеотид-киназы осуществляют перенос от [у = = "Р] АТР к 5 -концу интактной молекулы ДНК фага X. Затем необходимо провести полное расщепление меченой ДНК рестриктазой Яш dlll. Рестрикщсонные фрагменты разделяют с помощью электрофореза и идентифицируют положение каждого из фрагментов после окрашивания геля в растворе бромистого этидия. После этого гель накладывают на рентгеновскую пленку для идентификации двух меченых концевых фрагментов с помощью радиоавтографии. [c.282]

Оппсан метод [69], согласно которому гели сразу же после ИЭФ погружают в 0,2%- ный раствор бромфенолового синего в смеси этанол — вода — уксусная кислота (50 45 5 по объему). Для развития окраски достаточно одного часа, но и более длительное вьтдерживание гелей в окрашивающем растворе не причиняет никакого вреда, за исключением того, что высокая концентрация этанола может вызвать дегидратацию и сморщивание геля. Большое значение имеет концентрация спирта, так как ее снижение приводит к образованию осадка на поверхности геля. После окрашивания гелей избыток красителя отмывают в смеси этанол — вода — уксусная кислота (30 65 5 по объему), однако не следует слишком сильно обесцвечивать фон, так как при этом могут стать менее яркими и зеленые полосы белка. [c.155]

Малик и Берри [805] использовали реактив для фиксации и окрашивания белков, приготовленный на основе химически модифицированного кумасси яркого синего. 100 мл 2%-ного раствора кумасси яркого синего R-250 смешивают с равным объемом 2 н. серной кислоты и дают отстояться образовавшемуся осадку. К надосадочной жидкости по капля1м приливают 10 н. NaOH до появления голубоватого оттенка и, наконец, добавляют ТХУ до конеч ной концентрации 12 г/100 мл. Хроматографический анализ показал, что образовавшийся краситель отличается от исходного. В гелях, помещенных в полученный раствор, белковые фракции становятся видимыми через 15 мин в течение следующих 15 мин интенсивность окраски возрастает и затем уже не изменяется на протяжении 24 ч. Поэтому для окрашивания гелей данным методом установлено стандартное время — 30 мин, после чего гели переносят в воду, где они и хранятся. Если фон начинает окрашиваться, то достаточно поместить гели на короткое время в 0,2%-ную серную кислоту, чтобы эта окраска исчезла. Однако такую обработку следует [c.156]

Ускорения миграции красителя удается достигнуть и с помощью электрического поля. Швабе, [1151] предложил аппарат для быстрого электрофоретического окрашивания и обесцвечивания столбиков полиакриламидного геля, которые помещают на подложку, отделяющую катодный сосуд от анодного. Катодный сосуд заполняют 2%-ным раствором амидового черного 10 В в 5%-ной уксусной кислоте. Электрофорез длится 8 мин, что вполне достаточно для окрашивания гелей. Затем окрашивающий раствор заменяют разбавленной уксусной кислотой и продолжают электрофорез для удаления избытка красителя. [c.187]

Дезоксирибонуклеазы можно обнаруживать так же, как и рибонуклеазы. Бойд и Митчелл, [156] добавляли к акриламиду субстрат (нативную или денатурированную ДНК) перед полимеризацией геля. После электрофореза гели инкубировали и окрашивали присутствующую в них ДНК метиловым зеленым. Этот метод позволяет обнаружить 250 пг панкреатической ДНКазы. При сканировании гелей на денситометре при длине волны 260—265 нм окрашивание гелей можно не проводить [155]. [c.294]

Как уже отмечалось, фосфатазную активность можно обнаружить с помощью реакции азосочетания. С этой целью часто используют метод одновременного сочетания. Электрофореграммы инкубируют 15 мин при 25 С в растворе, содержащем 25 мМ нафтилфосфат, 1 мг/мл соли прочного красного ТК (диазотиро-ванный 2-амино-5-хлортолуол, ЕпСЬ) и 33 мМ буфер трис-НС1 [15, 16]. После окрашивания гели промывают водой для удаления избытка красителя. Субстратами для щелочных фосфа-таз могут служит как а-, так и -иафтилфосфаты. При использовании реакционной смеси, содержавшей 3,74 г/л борной кислоты, 2,04 г/л МдСЬ бНаО, 1 мг/мл соли прочного синего ВВ и один из нафтилфосфатов (pH доводят с помощью КОН до 9,7), [c.298]

Окрашивание красителем кумасси ярко-голубой. По завершении электрофореза белковые зоны локализуют путем окрашивания красителем кумасси ярко-голубой, обозначаемый в литературе как BBG250. Для окрашивания гелей используют [c.19]

Окрашивание растворами солей серебра. Наиболее чувствительный метод обнаружения белковых зон заключается в пропитывании геля раствором нитрата серебра затем гель обрабатывают восстановителем и раствором соды. При этом комплексы полипептид — серебро обнаруживаются в виде черных полос. Проявления солями серебра можно проводить после окрашивания красителем кумасси, который предварительно отмывают смесью метанол — уксусная кислота [138]. Наборы реактивов для окрашивания гелей солями серебра выпускаются компаниями Upjohn (гелькод) и Bio-Rad. Оба набора повышают чувствительность обнаружения с помощью кумаси в 250 и 50 раз соответственно. Гелькод позволяет обнаруживать белки при содержании 5—10 нг [154]. Как оттенок, так и интенсивность окрашивания солями серебра зависят от свойства анализируемого белка. Это свойство можно использовать для контроля за выделением исследуемого белка из сложной смеси. (Относительно методов обнаружения в геле см. разд. 8.19.) Поскольку метод обладает высокой чувствительностью, необходимо очень [c.19]

Фракционирование нуклеиновых кислот путем электрофореза в агарозе — это наиболее удобный метод анализа как ДНК так и РНК. В данной главе изложен метод электрофоретического разделения ДНК, предварительно обработанной рестриктазами. Метод основан на том, что скорость миграции линейных молекул ДНК в электрическом поле пропорциональна их. длине. Таким образом, можно довольно легко разделить фрагменты ДНК разной длины, а также определить размер, сравнивая скорость их миграции в геле с маркерными ДНК известного размера. Полосы ДНК видны при освещении ультрафиолетом после окрашивания геля флуоресцирующим интеркали-рующим красителем бромистым этидием в низкой концентрации. Такой метод окрашивания обладает большой чувствительностью и позволяет обнаруживать зоны, содержащие всего [c.280]

Более вероятно, что изменение состава гликопротеидов в клетках RF- EM происходит скорее вследствие увеличения интенсивности гликозилирования, чем за счет повышения содержания белка, так как различия между лекарственно устойчивыми и чувствительными клетками не были обнаружены путем включения Н-лейципа в белки или окрашивания геля кумасси голубым. [c.104]

Для окрашивания гель, находяшийся на стекле или подложке, помешают в краситель кумасси синий R примерно на 1 мин. Целесообразно использовать прозрачную кювету с подсветкой, чтобы наблюдать за развитием окраски. После окрашивания сливают краситель обратно во флакон и промывают пластину под струей воды. Помещают пластину в раствор для отмывания, чтобы устранить фоновое окрашивание, вновь промывают и высушивают. Гели на подложках Gelbond удобно хранить в альбоме. Стеклянные пластины с гелями хранят вертикально в стопках или в коробках, закрытых пленкой. [c.204]

Пример электрофореза на пластинке градиентного геля представлен на рис. 5. Культуру Е. соИ в экспоненциальной фазе роста инфицировали диким типом и различными атЬег-ыутттамш бактериофага Т4 и метили С-аминокислотами в интервале от 3 до 8 мин после заражения. Распределение отдельных белков, кодируемых фагом, определяли на радиоавтографе после окрашивания геля и обесцвечивания фона. На пластинке видно четкое разделение полипептидов, молекулярные веса которых различаются всего лишь на 200—500 дальтон. [c.105]

Другой метод окрашивания белков в полиакриламидном геле с помощью того же красителя в разведенной хлорной кислоте предложили Рейснер и сотр. (Reisner et al., 1975). Метод основан на том, что при связывании с белком краситель восстанавливает свой цвет, измененный в хлорной кислоте. Поскольку гель окрашивается в бледно-оранжевый цвет, а полосы белка — в интенсивно синий, при этом методе не требуется обесцвечивание. Кроме того, метод очень удобен для окрашивания гелей после изоэлектрофокусирования, так как краситель в хлорной кислоте не связывается амфолитами. [c.108]

Безфоновые методы окраски. Ригетти и Дрисдаль предложили метод окрашивания гелей после ИЭФ, в котором высокая чувствительность сочетается с низким уровнем фона. Гель погружают на 4—6 ч в 0,1%-ный раствор сернокислой меди (СиЗО ) в смеси уксусной кислоты, этанола и воды (19 25 65 по объему), содержащий также 0,05% красителя СВВ К-250. Сернокислая медь препятствует окрашиванию амфолитов. Гель отмывают сначала в течение 4 ч в том же растворе, но содержащем 0,01% красителя, затем в смеси тех же растворителей, но в несколько иной пропорции (1 1 8). Манипулировать с гелеМ следует в перчатках, так как метод достаточно чувствителен [c.35]

Рабочая концентрация акридинового оранжевого при окрашивании гелей 30 мкг/мл (в 0,01 М. Na-фосфатном буфере, pH 7), а продолжительность окрашивания — около 30 мин. Отмывать фон самого геля можно в том же буфере в течение 2—3 ч при комнатной температуре (лучше в эмалированной кювете, поскольку эмаль сорбирует акридиновый оранжевый, который потом нетрудно отмыть горячей водой). Гель фотографируют при освещении ультрафиолетовым светом (А, = 254 нм) на цветную пленку, например Polaroid Туре 108 olor film . [c.152]

Полноразмерный член семейства Ь1МЕ-1 человека (ееерху) аналогичен членам, обнаруженным у всех млекопитающих. Указано несколько характерных для приматов рестрикционных сайтов. Например, Крп1-фраг-менты длиной 1,5 и 1,2 т.п.н., образующиеся после эндонуклеазного расщепления геномной ДНК, присутствуют в гидролизате в достаточно большом количестве, чтобы их можно было обнаружить после электрофореза и окрашивания геля бромистым этидием. Учас- [c.204]

Пример 9-А. Анализ белков, образующихся при заражении бактерии Е. соИ фагом Т4. Если . oli инфицировать фагом Т4, то это приведет к синтезу большого числа белков-медиаторов фага. Относительное количество каждого из них и протекание во времени его синтеза можно изучить с помощью диск-электрофо-реза, используя для обнаружения белка радиоактивную метку. Если смесь всех белков, содержащихся в инфицированной клетке, подвергнуть электрофорезу и затем окрашиванию, гель окажется окрашенным практически равномерно, поскольку в нем будут присутствовать тысячи белков. Однако инфицирование фагом Т4 приводит к прекращению синтеза белков клетки-хозяина, поэтому, если заражение проводить в присутствии Н-лейцина, бактериальные белки не будут радиоактивными. Таким образом, для изучения синтеза белков при заражении фагом Т4 нужно добавлять Н-лейцин через различные промежутки времени после заражения и отделять клетки через несколько минут после каждого добавления Н-лейцина. Затем белки выделяют и разделяют с помощью диск-электрофореза, а зоны обнаруживают с помощью авторадиографии. При этом можно заметить, что в разное время образуются различные зоны. [c.237]

Для обнаружения нуклеаз при полимеризации геля в него вносят ДНК (10 мкг/мл) или РНК (25 мкг/мл). Если нуклеазы для своего действия нуждаются в ионах Mg " , Са " или то в их растворе ПААГ вымачивают после окончания электрофореза. Далее следует окрашивание геля красителем для нуклеиновых кислот—бромистым этидием (см. главу 4). Окрашивается весь гель, за исключением полос, содержащих нуклеазы, где нуклеиновая кислота разрушена. Можно вести разделение нуклеаз и в присутствии ДДС-Na, блокирующего их действие во время электрофореза. Перед обработкой бромистым этидием ДДС-Na из геля вымьюают. [c.103]

Определение молекулярных масс полипептидов проводят, используя в качестве стандартов набор белков ( Pharma ia , Швеция). После окрашивания гели сканируют, и молекулярные массы исследуемых полипептидов определяют по калибровочной кривой, которую строят для каждого геля по методике, прилагаемой к набору, при помощи программы Sigmagel . [c.57]

Нестабильность рекомбинанта, полученного на основе Х-вектора, во время репликации. Сегмент, содержащий тандемный повтор, клонировали в ),-векторе и после размножения фага из одной очищенной блящки выделяли ДНК, Далее ДНК гидролизовали с помощью рестриктирующей эндонуклеазы, подвергали электрофорезу и гель окрашивали бромистым этидием (слева). Затем осуществляли перенос ДНК по Саузерну и отжигали ее с клонированным зондом, содержащим такую же повторяющуюся последовательность. Вставка длиной 4,9 т,п,н, содержала большую часть повторяющегося сегмента, Однако с зондом ассоциировали и другие фрагменты ДНК-как более крупные, так и более мелкие (справа). Такие фрагменты содержались в субмоляр-ных количествах и не обнаруживались при окрашивании геля бромистым этидием. Встроенные фрагменты изображены в виде цветных полосок, Х-фрагменты - в виде черных. [c.338]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология