Препарат Кейлина Хартри

Хотя интактные митохондрии представляют собой удобный объект для изучения механизмов биоэнергетики, для решения ряда задач ис пользуют более простые системы — субмитохондриальные фрагменты К числу таких задач относится изучение переноса электронов в дыха тельной цепи, локализованной во внутренней мембране митохондрий Существование системы мембран, барьеров проницаемости, системы пе реноса энергии и др. очень осложняет однозначную интерпретацию кинетики окислительно-восстановительных реакций в интактных митохондриях. В связи с этим были разработаны методы получения более простых препаратов субмитохондриальных частиц. Последние могут быть получены при действии на митохондрии либо детергентов, либо сильных механических воздействий (ультразвук, растирание с песком и т. д.). К числу различных субмитохондриальных фрагментов относится так называемый препарат Кейлина—Хартри, представляющий собой фрагменты внутренней мембраны митохондрий, почти лишенные ферментов цикла Кребса. Препарат имеет полный набор дыхательных переносчиков, обладает высокими активностями НАД-Н и сукцинатокси-дазы, стабилен при хранении. [c.407]

Принцип получения препарата Кейлина—Хартри состоит в экстракции измельченной ткани солевыми буферными растворами, разрушении ее с помощью абразивных материалов и фракционировании центрифугированием. [c.407]

Примечание. 1. Препарат Кейлина—Хартри можно получать как из свежего, только что взятого материала, так и из замороженной мышцы. В последнем случае НАДН-оксидазная активность полученных препаратов очень невелика, тогда как на сукцинатоксидазную активность замораживание ткани не оказывает существенного влияния. [c.408]

Приготовление субмитохондриальных частиц, лишенных сукцинатдегидрогеназы. К 10 мл суспензии препарата Кейлина—Хартри осторожно при комнатной температуре добавляют 1 н. КОН до pH 9,3. [c.417]

Ниже приведены методы получения всех четырех комплексов. В качестве исходного материала (нативная дыхательная цепь) могут быть использованы либо ультразвуковые субмитохондриальные фрагменты, либо препарат Кейлина—Хартри (с. 407). [c.415]

Реактивы, необходимые для выделения препарата Кейлина— Хартри (с. 407). [c.416]

Препарат Кейлина—Хартри, суспендированный в 50 мМ фос-фатно-боратном буфере (концентрация белка около 10 мг/мл). [c.416]

Получение растворимой сукцинатдегидрогеназы. К 46 мл препарата Кейлина—Хартри (с. 407) добавляют 4 мл 0,6 М сукцината калия, суспензию деаэрируют продуванием азота в течение 15—20 мин. Колбу плотно закрывают и оставляют стоять на ночь при 0° С. На следующий день суспензию продувают азотом в течение 15—20 мин, доводят pH под слабым током азота до 9,35 (пользуются 1 н. КОН) и переносят в двухгорлую колбу, снабженную трубкой для пропускания азота (рис. 49). [c.416]

Реактивы для получения препарата Кейлина—Хартри (с. 407). [c.421]

Выделяют препарат Кейлина—Хартри (см. с. 407). 100 мл препарата, суспендированного в 0,15 М КС1 в концентрации 20 мг/мл, замо- [c.421]

Выделяют препарат Кейлина—Хартри из двух сердец быка (с. 407). Препарат тщательно суспендируют в 0,25 М сахарозе и доводят содержание белка до 40 мг/мл, замораживают при —20° С. Все процедуры выделения проводят при температуре О—4° С. В стакане на 0,5 л к 75 мл замороженного и тщательно суспендированного препарата добавляют буфер I до суммарного объема 120 мл и 5 мл 1 М сукцината натрия. Смесь инкубируют 20 мин. Затем при хорошем перемешивании по каплям из делительной воронки добавляют 125 мл [c.424]

Получение препарата S R. Препарат Кейлина—Хартри (получение см. на с. 407) суспендируют в 0,1 М фосфатном буфере (натриевые соли), содержащем 0,2 мМ ЭДТА, pH 7,4. Содержание белка в суспензии доводят до 30 мг/мл. Стакан с суспензией помещают на лед и при хорощем перемешивании (магнитная мешалка) медленно добавляют холат натрия (pH 7,4) из 10—20%-ного раствора до конечной концентрации 1%. К суспензии, содержащей детергент, небольшими порциями шпателем добавляют мелко растертый сульфат аммония из расчета 144 г/л. После добавления каждой трети требуемого количества сульфата аммония pH суспензии проверяют и при необходимости доводят до 7,4 концентрированным раствором аммиака. Смесь оставляют при хорошем перемешивании на холоде на 1 ч и после этого добавляют сульфат аммония из расчета 61 г/л. pH суспензии проверяют и при необходимости доводят до 7,4. Спустя 20 мин смесь центрифугируют при 40 000gf в течение 1 ч. Прозрачный краснооранжевый супернатант сливают в охлажденный мерный цилиндр через 4 слоя марли, избегая вспенивания и загрязнения супернатанта рыхлым слоем осадка. [c.427]

К известному объему супернатанта на холоде при хорошем перемешивании медленно добавляют сульфат аммония (каждую следующую порцию после полного растворения предыдущей) из расчета 94 г на 1 л супернатанта. Через 20 мин помутневшую смесь центрифугируют 30 мин при 40 000gf. Супернатант после центрифугирования отбрасывают, осадок растворяют, помешивая палочкой, или в свободном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в 1/4 исходного объема суспензии препарата Кейлина—Хартри в смеси, содержащей 0,1 М фосфатный буфер, 0,5%-ный холат и 0,2 мМ ЭДТА (натриевые соли), pH 7,4. Прозрачный или слегка мутный раствор оставляют при слабом перемешивании в холодной комнате на ночь. [c.427]

Выделение цитохромоксидазы. Выделяют препарат Кейлина— Хартри из двух сердец быка (с. 407), [c.433]

В настоящей работе предлагается изучить действие ингибиторов на суммарную реакцию, катализируемую дыхательной цепью — поглощение кислорода. Опыты проводят с препаратами Кейлина—Хартри, для измерения потребления кислорода пользуются полярографическим методом (с. 480). [c.435]

Выделяют препарат Кейлина—Хартри (с. 407). [c.436]

Пять кювет полярографа заполняют раствором, содержащим ,1 М фосфатный буфер (pH 7,6) и цитохром с (100 мкг/мл). Объем раствора в каждой кювете — 2 мл. В пробы с помощью микропипеток добавляют сукцинат в конечных концентрациях 0,3 0,6 1,25 5,0 мМ. Измеряют скорость дыхания в присутствии различных концентраций субстрата. Для этого кювету устанавливают в штативе полярографа, погружают в нее электроды. После установления начального значения тока добавляют 0,05 мл суспензии препарата Кейлина—Хартри (1,5 мг/мл) и регистрируют поглощение кислорода. Во всех пробах рассчитывают скорость дыхания в микромолях поглощенного кислорода за 1 мин на 1 мг белка. [c.436]

Выделяют субмитохондриальные фрагменты из сердца быка (препарат Кейлина—Хартри, см. с. 407). Полученные в ходе выделения [c.439]

В полярографическую кювету, содержащую 2 мл среды инкубации,, погружают электроды, вносят 50 мкл суспензии обработанных антимицином митохондрий, добавляют 5 мМ малат и 5 мМ глутамат и через 1—2 мин вносят 50 мкл густой (50—70 мг/мл) суспензии препарата Кейлина—Хартри. Внесение субмитохондриальных фрагментов практически не вызывает стимуляции поглощения кислорода. Реакцию инициируют добавлением 4 мкМ Qa (осуществляющего перенос элект ронов между митохондриями и субмитохондриальными фрагментами неспособными окислять малат). По ходу реакции добавляют 100 мкМ динитрофенол и регистрируют увеличение скорости поглощения кисло рода. В том случае, если стимуляция разобщителем не наблюдается рекомендуется вдвое понизить количество вносимого препарата Кей лина—Хартри и (или) уменьшить концентрацию вносимого Q i. Нов торяют измерение с другими гомологами убихинона Qi (3 мкМ) и Qe (3 мкМ). Убеждаются в полной чувствительности наблюдаемой убихинон-редуктазной активности (измеренной с различными гомологами убихинона) к ротенону. С этой целью в кювету по ходу реакции вносят 5 мкМ ротенон и наблюдают полное ингибирование реакции. [c.440]

В настоящей работе предлагается изучить кинетику торможения НАДН-оксидоредуктазной активности препарата Кейлина—Хартри ро-теноном и определить кинетические и термодинамические параметры связывания ингибитора с ферментом. Реакция окисления НАДН кис--лородом сопровождается поглощением стехиометрического протона и может быть измерена с помощью регистрирующего рН-метра. [c.441]

Определение константы скорости инактивации фермента ротено-ном. Выделяют препарат Кейлина—Хартри, Кювету рН-метра (объ-<емом 4,5 мл) заполняют средой измерения активности (п. 2) и добавляют НАДН до конечной концентрации в кювете, равной 1 мМ. В кювету погружают отмытый рН-электрод, через 2—3 мин вносят 50 мкл суспензии Кейлина—Хартри ( — 25 мг/мл) и регистрируют изменение pH в ходе НАДН-оксидазной реакции. По ходу реакции в кювету вносят ротенон (0,1 мкМ) и наблюдают ингибирование ферментативной активности, связанное с образованием каталитически неактивного комплекса фермент-ротенон. Внося ингибитор в различных концентрациях (0,025 0,05 0,075 0,1 0, 5 мкМ), определяют зависимость скорости инактивации от концентрации ротенона и рассчитывают величину константы второго порядка скорости инактивации фермента ингибитором. [c.441]

При измерении активности на рН-метре необходимо после завершения каждого измерения определять цену деления шкалы на самописце. Для этого в кювету вносят небольшой объем (0,02—0,05 мл) титрованной НС1 (50 мМ) и фиксируют величину отскока пера самописца. 3. Ферментативную активность выражают в мкмолях окисленного НАДН за 1 мин в расчете на 1 мг белка препарата Кейлина — Хартри. [c.442]

Важным методом изучения цепи переноса электронов является разделение митохондриальных мембран на фрагменты, сохраняющие способность катализировать отдельные реакции цепи. Существует много методов, используемых для получения субмитохондриальных частиц. Широкоизвестный препарат Кейлина—Хартри из сердечной мышцы получают гомогенизацией митохондрий и осаждением фракций при низких значениях pH. Хотя получаемые в результате частицы имеют низкое-содержание цитохрома с и не способны к окислительному фосфорилированию, они активно дышат . С помощью ультразвука был получен другой тип переносчиков электронов. Под электронным микроскопом такие-частицы выглядят как маленькие образованные мембранами пузырьки,, напоминающие митохондриальные кристы. [c.399]

По ряду причин митохондрии из сердечной мышцы быка особенно удобны для изучения переноса электронов, т. е. окисления кислородом восстановленного НАД и сукцината. Именно из этой ткани удалось впервые выделить модифицированную дыхательную частицу ( препарат Кейлина — Хартри , впервые описанный в 1940 г.). Система переноса электронов в митохондриях из сердечной мышцы быка отличается особенно высокой стабильностью, что зависит, возможно, от чрезвычайно низкого содержания протеолитических ферментов. Кроме того, здесь с дыхательной цепью связано минимальное количество других дегидрогеназ. Наконец, эти митохондрии, по-видимому, не имеют других систем, окисляющих восстановленный НАД, в отличие от митохондрий печени млекопитающих. [c.389]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология