Олигонуклеотиды химический синтез, метод

С разработкой быстрых и недорогих методов химического синтеза фрагментов ДНК методология молекулярно-биологических исследований ДНК существенно изменилась. Химически синтезированные олигонуклеотиды можно использовать для конструирования целых генов или их фрагментов, для амплификации специфических фрагментов ДНК, для направленных мутаций изолированных ДНК, а также в качестве зондов при гибридизации и в качестве линкеров, облегчающих клонирование. [c.47]

Несмотря на применение защищенных производных нуклеотидов и нуклеозидов, некоторые побочные реакции (например, образование пирофосфатов при синтезе исходя из моноэфиров фосфорной кислоты) все же имеют место вследствие этого требуется тщательная хроматографическая очистка продуктов реакции. Одним из приемов, позволяющих существенно упростить очистку продуктов реакции, является фиксация одного из компонентов реакционной смеси на полимерном носителе Такой полимер может быть легко отделен от других компонентов реакционной смеси. Продукт реакции, фиксированный на полимере, можно подвергать дальнейшим превращениям, что значительно упрощает многостадийные синтезы. Наконец, после выполнения всех стадий продукт может быть отщеплен от полимера и выделен в чистом состоянии. Такой подход к синтезу олигонуклеотидов привлекает сейчас большое внимание . Неспецифичность химических методов создания межнуклеотидной связи, являющаяся недостатком химического подхода к синтезу олигонуклеотидов (получение защищенных производных нуклеозидов и нуклеотидов требует многостадийных синтезов), в данном случае дает ряд преимуществ, поскольку в синтез олигонуклеотидов могут быть введены самые разнообразные производные нуклеозидов, в том числе и синтетические аналоги компонентов нуклеиновых кислот. Это открывает широкие возможности исследования связи структуры и функции природных полинуклеотидов. [c.86]

Хроматографические методы, позволившие разделить продукты химического или ферментативного гидролиза нуклеиновых кислот, сделали возможным в последние годы объяснение строения последних [14, 15, 44, 91]. Эти методы служат также для анализа мононуклеотидов [91, 92], олигонуклеотидов и смесей полинуклеотидов, получающихся при химическом синтезе [36, 44, 45, 90] или под действием ферментов [50, 65, 66). [c.451]

Химический синтез нуклеиновых кислот (в биологическом смысле этого слова) пока еще не осуществлен, однако в конечном счете это будет достигнуто при условии, что будет определена точная структура природных полимеров. Методы полимеризации мононуклеотидов оказались уже сейчас пригодными для синтеза олигонуклеотидов и низших полинуклеотидов при контроле последовательности нуклеотидов. [c.467]

Использование синтетических олигонуклеотидов. Другой методический подход, применяемый для определения места расщепления рестриктаз, стал доступен благодаря созданию эффективных методов химического синтеза олигодезоксрибонуклеотидов. Основной прогресс в этой области был связан с разработкой более совершенного фосфотриэфирно-го [256] и фосфоамидитного методов [175] и перехода от синтеза в растворе на синтез с использованием полимерных носителей [71, 175]. [c.179]

В последние годы достигнут значительный прогресс в автоматизации и ускорении синтеза олигонуклеотидов, тем не менее химический синтез гена — большой трудоемкий процесс. Другое ограничение этого метода связано с необходимостью точно знать первичную структуру белка, что не всегда доступно. [c.98]

Синтез РНК по ДНК называется транскрипцией Матрицей для транскрипции могут служить короткие олигонуклеотиды, синтезированные чисто химическими методами, причем длина получаемых цепей может быть значите. ЩО больше, чем у исходной ДНК Объясняется это тем, что после образования части молекулы РНК происходит вытеснение ее с матрицы, так как связь ДНК с ДНК более прочна, чем с РНК. [c.337]

Вопросы разработки методов синтеза олиго- и полинуклеотидов в последнее время привлекают большое внимание исследователей. Это связано с тем, что синтетические олигонуклеотиды стали использоваться для идентификации фрагментов природных нуклеиновых кислот, изучения их химических свойств, а также как инструмент исследования в молекулярной биологии и молекулярной генетике (для расшифровки генетического кода, функционирования генома, процессов взаимодействий нуклеиновых кислот с белками, в том числе ферментами нуклеинового обмена, антибиотиками и т. д.). [c.280]

Ферменты играют огромную роль в развитии технологии рекомбинантной ДНК. Химическая трансформация ДНК, необходимая для целей генетической инженерии, не может быть обеспечена традиционными методами химии-нуклеиновых кислот, и поэтому масштабное внедрение методов генетической инженерии в значительной степени зависит от использования ферментов. Особую роль здесь играют ДНК-лигаза и эндонуклеазы рестрикции. Интерес представляет не только ферментативная модификация макромолекул, но также и ферментативный синтез олигонуклеотидов. [c.61]

Рассматривая историю развития химического модифицирования, необходимо упомянуть о блестящей идее Р. Б. Меррифилда, который в начале 1960-х гг. предложил, а затем реализовал сборку олигопептидов на функционализированных органических и минеральных матрицах [15]. В 70-е гг. метод Меррифилда (Нобелевская премия 1984 г.) бьш распространен на синтез олигонуклеотидов [16] и олигосахаридов [17]. В настоящее время применение реагентов, ковалентно закрепленных на носителе, прочно вошло в арсенал синтетических методов органической химии [18]. [c.13]

Чтобы выход продукта был достаточно высок, эффективность присоединения нуклеотидов на каждом этапе должна быть не ниже 98%. Эффективность контролируют спектрофотометрическими методами, определяя количество удаляемых тритильных групп. Если, например, при синтезе 20-членного олигонуклеотида эффективность каждого цикла равна 99%, то 82% (т. е. 0,99 100) олигонуклеотидов будут иметь именно такую длину. Если же синтезируется 60-членный олигонуьслеотид, то при той же эффективности только 55% олигонуьслеотидов будут содержать по 60 нуклеотидов. А если средняя эффективность цикла не превышает 98%, то доля олигонуклеотидов заданной длины будет гораздо ниже (табл. 5.1). Фирмы - изготовители коммерческих ДНК-синтезаторов обычно гарантируют среднее значение эффективности присоединения 98%. Но для этого необходимо использовать реагенты и химикаты очень высокой степени чистоты, что не всегда удается выполнить. Как правило, реальная эффективность присоединения составляет 95%, хотя иногда удается достичь и 99%-ной эффективности. Чтобы получить олигонуклеотиды заданной длины, первичные продукты большинства химических синтезов необходимо очистить с помощью либо высокоэффетивной жидкостной хроматографии под высоким давлением с обращенной фазой, либо электрофореза в полиакриламидном геле. Поскольку все неудачные последовательности короче, чем тот олигонуклеотид, который хотят получить, сделать это нетрудно. [c.85]

С разработкой в начале 80-х гг. быстрых, эффективных и недорогих методов химического синтеза олигонуклеотидов появилась возможность использовать радиоактивно меченные олигонуклеотидные зонды для выявления различий между нуклеотидными последовательностями, в частности для обнаружения мутаций у человека. К тому времени было изолировано относительно небольшое число генов, главным образом в виде комплементарных ДНК (кДНК), поэтому подбор зонда, гомологичного конкретному гену, представлял собой непростую задачу. Но даже если соответствующие кДНК были получены, невозможно было различить нормальный и мутантный гены чело- [c.189]

Олигорибонуклеотиды. Методы химического синтеза в этом ряду соединений разработаны значительно меньше, чем в случае олигодезоксинуклеотидов. Относительно доступными являются лишь тринуклеозиддифосфаты синтезу же олигонуклеотидов [c.93]

Следующим щагом в развитии методов химического синтеза генов стало создание специализированных компьютерных программ, которые позволят оптимизировать структуру олигонуклеотидов, чтобы свести к минимуму образование комплексов, приводящих к появлению побочных продуктов. Одним из первых примеров использования такой программы для выявления самокомплементарных и повторяющихся последовательностей оснований служит работа по синтезу гена эпидермального фактора роста, предназначенного для экспрессии в клетках Е. oll. Целевой ген, кодирующий 53 аминокислоты, был разбит на 23 олигонуклеотида. На рис. 1.42 приведен фрагмент составленной с помощью ЭВМ схемы последовательной сборки целевой ДНК из 17 промежуточных блоков-интермедиатов, каждый из которых был выделен в индивидуальном состоянии. Несмотря на оче- [c.63]

Блестящие успехи в разработке методов химического синтеза олигонуклеотидов, доступность высокоочищенных ферментов нуклеинового обмена привели к тому, что процедуры сайтспецифического мутагенеза могут при необходимости применяться в любой молекуляр-но-биологической лаборатории. Данные методы стали неотъемлемой частью исследований, направленных на изучение структурно-функциональной организации генов и белков. Некоторые из этих работ рассмотрим в следующей главе. [c.185]

Благодаря разработке и совершенствованию методов клонирования и идентификации генов, секвенирования последовательностей ДНК, химического синтеза олигонуклеотидов, направленного мутагенеза молекул ДНК in vitro и оптимизации экспрессии целевых генов в клетках Е. соИ появилась возможность создавать мутантные формы генов и нарабатывать в достаточных для анализа количествах соответствующие им измененные варианты изучаемых белков. В целом направление исследований по конструированию методами генетической инженерии белков с измененными по отношению к природному прототипу свойствами, химерных белков, обладающих свойствами двух или более отдельных белков, и т. п., т. е. создание неприродных вариантов бежов и изучение их свойств, получило название белковая инженерия . [c.187]

Химический синтез гюлидезоксинуклеотидов. Для химического синтеза полидезоксинуклеотидов щироко применяют два метода. В обоих случаях исходными строительными блоками являются дезо кс при б онуклеоз иды, и оба метода включают этап связывания мононуклеотидов и олигонуклеотидов. Методы полностью автоматизированы при этом используется установка Синтезатор ДНК . [c.280]

Вся полимеразная цепная реакция осуществляется in vitro с использованием ДНК-полимеразы и олигонуклеотид ных праймеров, комплементарных двум З -концам участков, офаничивающих ампли-фицируемый дуплексный сегмент. Таким образом, разработка НЦР-метода стала возможной лишь после того, как были созданы методы быстрого и недорогого химического синтеза олигонуклеотидов (разд. 6.1.в). Для осугцествления реакции необходимо знать нуклеотидную последовательность того участка, который мы хотим амплифицировать, чтобы можно было синтезировать соответствующие олигонуклеотидные праймеры. При творческом применении НЦР-метода он существенно дополняет методы молекулярной генетики, и если бы часть II книги не была фактически завершена до того, как этот метод был окончательно разработан, его основы были бы обязательно изложены в гл. 5-7. [c.360]

Огромный вклад в дело химического синтеза олигонуклеотидных блоков с заданной последовательностью внес уже упоминавшийся Х.Г.Корана, которому вместе с коллегами пришлось преодолеть многочисленные трудности. Так, 60-е и начало 70-х годов двадцатого столетия были периодом фосфодиэфирного синтеза, который позволил сдвинуть весь этот пласт, но оказался непригоден для широкого использования из-за своей крайней медлительности, поскольку средняя скорость нарагцивания олигонуклеотидной цепи этим методом составляла одно звено в месяц. Более того, осугцествить подобный процесс мог только высококлассный химик, обладавший к тому же адским терпением. С появлением в начале 70-х гг. фосфотриэфирного метода, скорость синтеза заметно возросла, что постепенно превратило процесс получения олигонуклеотидов в довольно рядовое событие. [c.12]

Разработаны методы синтеза полинуклеотидов — простейших моделей нуклеиновых кислот. Эти методы послужили основой для синтеза олигонуклеотидов с заданной последовательностью нуклеотидов. Использование химических и биохимических методов синтеза дали возможность Каране получить полинуклеотид, соответствуюший активному фрагменту дезоксирибонуклеиновой кислоты. Все эти достижения в области исследования строения, функций и синтеза биополимеров позволили на другом, новом—молекулярном уровне подойти к изучению жизненных процессов. Есть все основания предполагать, что в ближайшее время нас ждут большие и интересные открытия в мире познания самых сложных и тонких областей жизнедеятельности организма (деятельности нервной системы, межклеточного взаимодействия, явлений иммунитета и т. д.). [c.54]

В настоящее время методы синтеза олиго-. и полинуклеотидов разработаны в такой степени, что в короткие сроки могут быть получены искусственные фрагменты ДНК большой длины и практически любого состава. Достигнут существенный прогресс и в синтезе полирнбонуклеотидов. Общая стратегия синтеза полинуклеотидов и нуклеиновых кислот заключается в комбинированном использовании химических и ферментативных методов. Относительно небольшие олигонуклеотиды синтезируют химически, а затем соединяют в длинные цепн с помощью соответствующих ферментов. [c.348]

С развитием методов синтеза олигонуклеотидов стало возможным получать чисто химическими способами 30 — 60- и даже 100-звеиные олигомеры. С одной стороны, это привело к упрощению описанной методологии (за счет существенного сокращения числа лигазных реакций при сборке геиа), а с другой — создало основу для разработки принципиально иного подхода к получению синтетических дуплексов. Такой подход, предложенный К. Итакура и сотр., заключается в репаративной достройке с помощью ДНК-полиме- [c.371]

До недавних пор создание искусственного гена химическими методами было очень трудным делом. В настоящее время синтез искусственных олигонуклеотидов вполне обычен. Таким образом, технология для конструирования человеческих генов у нас в руках, и можно считать вполне ре-альньш в будущем синтез генов с любой желаемой последовательностью нуклеотидов и информационным содержанием. С помощью упоминавшихся выше фермен-тов-рестриктаз такие гены можно затем встраивать по желанию в любой геном. [c.167]

Возможны два способа получения модифицированных ДНК-субетратов — химическая модификация канонического субстрата и введение модифицированного основания в ходе его синтеза. Субстраты синтезированые химическим методом имеют некоторые преимущества перед макромолекулярными ДНК. В первую очередь в олигонуклеотиды легче ввести задуманную модификацию при его конструировании, чем модифицировать природную ДНК, а затем убеждаться в полноте ее модификации. Применяя синтетические олигонуклеотиды, можно оценить расщепление сайта с различным нуклеотидным окружением в отсутствии других эффектов, например, сверхскрученности ДНК, неканонических вторичных структур (например, 2-ДНК или крестообразные структуры остова), а также неспецифического взаимодействия ферментов с другими сайтами. Для выяснения картины взаимодействия рестриктаз с ДНК, создаются синтетические ДНК-фрагменты имеющие [c.78]

Для более тонкой структурной реорганизации гена (результатом которой является замена одной или нескольких аминокислот в кодируемом белке) требуются специальные методы. Сначала химическим путем синтезируют небольшую молекулу ДНК, содфжащую измененную часть нуклеотидной последовательности данного гена. Затем этот синтетический олигонуклеотид гибридизуют с одноцепочечной плазмидой ДНК, в составе которой присутствует последовательность ДНК, подлежащая изменению гибридизацию ведут в условиях, допускающих спаривание не вполне подходящих пфтнеров (рис. 5-87). Синтетический олигонуклеотид становится затравкой для ДНК-полимфазы, осуществляющей синтез ДНК, в результате которого образуется молекула, содфжащая ген с встроенной в него измененной последовательностью. После этого модифицированный ген включают в экспрессирующий вектор, что позволяет получить измененный белок в достаточном количестве для детального изучения. Заменяя таким путем те или иные аминокислоты в молекуле интересующего нас белка, можно выяснить, какие именно части полипептидной цепи ответственны за такие фундаментальные процессы, как свертывание белка, взаимодействие белка с лигандом или ферментативный катализ. [c.337]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология