Рестрикция ДНК частичная

Один из таких приемов заключается в неполном расщеплении. В определенных условиях эксперимента рестриктаза узнает и расщепляет не все свои мишени в каждой молекуле ДНК. Например (рис. 3.3), при частичном расщеплении ДНК ферментом А могут образоваться фрагменты 3100 п.н., 1400 п.н. и 500 п.н. Сопоставив их с тем, что получается после полного расщепления, можно сразу расположить фрагменты 2100 п.н. и 1100 п.н. рядом, как составляющие фрагмента 3100 п.н. Таким путем можно последовательно расположить сайты рестрикции одного фермента. При неполной рестрикции можно также получить фрагмент 3500 п. н. тогда можно расположить рядом фрагменты 2100 п.н. и 1400 п.н. [c.46]

Поэтому для создания удобной библиотеки путем клонирования рестриктов пользуются приемом, так регулирующим частоту внесения разрывов, чтобы получились более длинные фрагменты. Для этого используют фермент с короткой (4 п. н.) последовательностью узнавания в условиях, обеспечивающих частичную рестрикцию [c.243]

Предположим, например, что ген содержит интрон, имеющий два сайта рестрикции для некоторого фермента, как показано на рис. 20.14. При разрезании гена по этим сайтам два фрагмента-левый (А) и правый (В)-будут состоять частично из последовательности, представ- [c.251]

Для определения последовательности нуклеотидов в ДНК было создано несколько методов. Во всех этих методах ферменты рестрикции используются для фиксации специфических точек отсчета . Последовательность нуклеотидов определяют в одноцепочечных фрагментах, состоящих из 100-200 нуклеотидов. Более длинные последовательности составляются из коротких фрагментов с частично перекрывающимися концами. При секвенировании комплементарной цепи проверяется правильность описания последовательности нуклеотидов в первой цепи. [c.273]

При конструировании космидной библиотеки, вероятно, наиболее важное значение имеет качество используемой ДНК-Лишь около трети фрагментов ДНК длиной 40—50 т. п. н., полученных из молекул с исходным размером 100 т.п.н., содержат сайты рестрикции на обоих концах. Разорванные молекулы конкурируют в реакции лигирования, что делает невозможным создание хорошей библиотеки. При выделении ДНК необходимо соблюдать следующее условие на каждой из стадий выделения (частичный гидролиз, градиентное центрифугирование и т.д.) рекомендуется проверять ДНК в 0,2%-ном агарозном геле. Инструкции по применению этих гелей приведены в разд. 2.3.4. Для получения высокомолекулярной ДНК мы используем метод, детали которого описаны в табл. 2.1. Метод этот пригоден при работе со свежими и с замороженными клетками и тканями. [c.44]

Рис. 5-60. Карта рестрикции клонированного вами сегмента ДНК и продукты частичного расщепления, по которым она составлена (ответ 5-50). Числа рядом с фрагментами означают их длину, определение которой проиллюстрировано на рис. 5-42.

Один из способов создания библиотеки ДНК состоит в обработке донорной ДНК рестриктазой, уз-наюшей тетрануклеотиды. Такой рестриктазой является БаиЗМ, которая вносит один разрыв примерно на 256 пар оснований. Гидролиз проводят в таких условиях, чтобы происходило лишь частичное расщепление, так что образуются фрагменты всевозможных размеров (рис. 4.10). Частичный гидролиз позволяет клонировать целые гены, однако, поскольку сайты рестрикции расположены не случайным образом, некоторые фрагменты могут оказаться слишком крупными для клонирования. В результате в распоряжении исследователя оказьшается неполная библиотека, что может затруднить или даже сделать невозможным обнаружение искомой [c.63]

Частично вырожденные олигонуклеотиды могут быть встроены в ген-мишень разными способами. Один из подходов состоит в следующем. Ген встраивают в плазмиду между двумя унжальными сайтами рестрикции и проводят амплификацию его [c.165]

Рис. 8.6. Случайный мутагенез с использованием вырожденных олигонуклеотидов и ПЦР. Левую и правую части гена-мишени амплифицируют по отдельности с помощью ПЦР. Соответствующие праймеры показаны горизонтальными стрелками. Вырожденные олигонуклеотиды изображены стрелками с тремя зазубринами, каждая из которых отвечает нуклеотиду, не комплементарному соответствующему нуклеотиду в гене-мишени. Амплифици-рованные фрагменты очищают, денатурируют до полного разделения цепей и ренатури-руют. В результате образуются частично двухцепочечные молекулы ДНК, спаренные в области гена-мищени. Их достраивают с помощью ДНК-полимеразы и проводят ПЦР-амплификацию. ПЦР-продукты расщепляют эндонуклеазами рестрикции А и В и встраивают в вектор, обработанный теми же ферментами.

Мультилокусные зонды дают наилучший результат при использовании чистой, беспримесной ДНК. Однако судебные медики редко работают на свежем материале хорошего качества. Как правило, образцы чем-то загрязнены, например почвой или бактериями. Часто требуется более мощный метод. Этого достигают с помощью однолокусного зонда. Такой зонд можно использовать при работе с небольшими участками ДНК (например, с частично разрушенной ДНК), а также с малым количеством материала. Зонд распознает лишь одиночную короткую повторяющуюся последовательность, которая уникальна для одного минисателлита и поэтому обнаруживается только на определенной паре гомологичных хромосом. При рестрикции образуются два характерных фрагмента для каждого индивидуума, и, следовательно, на радиоавтографе появятся две полосы, одна материнского и одна отцовского происхождения (рис. 25.35). Если используют два однолокусных зонда, то появится четыре полосы если три, то — шесть, и т. д. Если требуется очень высокая достоверность в определении различий между двумя индивидуумами, то нужно использовать большое количество зондов (см. ниже). Этот метод называют генотипи-рованием, а получаемый при этом профиль используют в судебной экспертизе чаще всего. [c.266]

Метилаза добавляет за один раз только одну метильную группу. Так, в случае неметилированного субстрата одно метилирование сопровождается отделением метилазы от ДНК. Для введения второй метильной группы требуется отдельное связывание и событие метилирования. Поскольку репликция полностью метилированной ДНК всегда ведет к образованию частично метилированной ДНК (см, рис. 34.1 и рис. 31.15), узнавание частично метилированных сайтов является, вероятно, обычным способом действия метилазы in vivo. Фермент рестрикции не связывается с метилированными сайтами-мишенями. [c.433]

Для препаративной рестрикции используйте найденные точ 1ые условия частичного гидролиза и — для гарантии — близкие варианты ( 50% фермента), [c.46]

Существенный фактор при выполнении ДНК из растительных клеток — эффективное разрушение клеточных стенок. К сожалению, многие методы, используемые для этого, приводят к фрагментации ДНК. и, следовательно, в каждой конкретной ситуации достигается определенный компромисс между размером ДНК и ее выходом. Эту трудность можно частично преодолеть при использовании лиофилизированного материала (разд. 4.2). Однако высвобождение высокомолекулярной ДНК — это только часть задачи, поскольку экстракты растительных клеток содержат большие количества полисахаридов, таннинов и пигментов, которые в ряде случаев весьма трудно отделить от ДНК. Хуже того, некоторые полисахаридоподобные примеси невозможно определить обычными аналитическими методами, не приводящими к разрушению ДНК- Такие примеси препятствуют правильному определению количества нуклеиновых кислот спектрофотометрическими методами и дают аномальную кинетику гибридизации. Кроме того, что гораздо важнее, они могут подавлять активность большинства ферментов, модифицирующих ДНК, в том числе и ферментов рестрикции. Это может затруднять как анализ ДНК методом блоттинг-гибридизации по Саузерну, так и ее клонирование. [c.237]

Использование рационального редизайна полипептидных цепей рестриктаз E oRl и E oRV с целью изменения их субстратной специфичности пока не завершилось успехом [320]. Замены аминокислотных остатков, вовлеченных в процесс распознавания субстрата, неизменно сопровождались снижением специфичности фермента и уменьшением его удельной активности. Предполагается, что сложная сеть ДНК-белковых взаимодействий при взаимодействии рестриктазы с ДНК формируется кооперативно, и любые вмешательства в эту сеть приводят к отрицательным последствиям. В настоящее время остаются в значительной степени непонятными энергетические характеристики динамических структур, формирующихся в комплексах фермент-ДНК, а также, что еще более важно, нет возможности количественной оценки влияния каждого контакта в таких комплексах на все другие контакты, то есть на кооперативность взаимодействий. Кроме того, на сегодняшний день отсутствует понимание структурных и термодинамических особенностей, а также функциональной роли альтернативных конформаций ферментов, которые он принимает в комплексах с частично измененными сайтами рестрикции и которые не может расщеплять. Однако без таких знаний трудно рационально воздействовать на специфичность действия рестриктазы. [c.443]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология