Метод адсорбции и элюции ферментов

История развития отечественной биохимии. Российские ученые внесли большой вклад в развитие биохимии. Основоположником отечественной биохимии по праву считают А. Я. Данилевского (1839—1923), который возглавил в Казанском университете первую в России кафедру биохимии и создал первую русскую школу биохимиков. А. Я. Данилевский сделал ряд крупных открытий. Им разработан оригинальный метод очистки ферментов путем их адсорбции с последующей элюцией. Он впервые высказал идею об обратимости действия биологических катализаторов—ферментов и, исходя из этого, осуществил синтез белковоподобных веществ—пластеинов. Занимаясь изучением белков, А. Я. Данилевский предположил, что составляющие их структурные единицы соединены друг с другом —СО—NH-связями, которые были названы впоследствии пептидными. По современным представлениям, белковая молекула построена из остатков аминокислот, соединенных пептидными связями. [c.10]

Большое значение для очистки и разделения отдельных ферментов друг от друга сыграли методы, основанные на возможности избирательной а д-сорбции ферментов на поверхности частиц мелко раздробленных адсорбентов, с последующей их элюцией. Этот способ очистки ферментов впервые был предложен А. Я. Данилевским. Позднее метод адсорбции был усовершенствован и с успехом применялся Вильштеттером и др. [c.134]

Сок поджелудочной железы так же, как водный экстракт из этой железы, обладает способностью расщеплять белки, жиры и крахмал. В 1862 г. Данилевский сообщил, что ему удалось соответствующей обработкой экстракта из поджелудочной железы отделить трипсин от амилазы. Он впервые применил метод адсорбции (связывание иа поверхности) ферментов с последующей их элюцией (освобождение с поверхности). Метод адсорбции и элюции широко использовался Вильштеттером в первой четверти нашего столетия в его работах по очистке ферментов. [c.167]

Адсорбционный метод Данилевского основан на способности ферментов адсорбироваться при определенных условиях на поверхности некоторых мелко измельченных веществ (гидроокись железа, глины, животный уголь и др.). После взбалтывания раствора фермента с надлежащим образом подобранным адсорбентом фермент оказывается адсорбированным на частицах твердого тела и увлекается вместе с этим частицами в осадок при отстаивании, фильтровании или центрифугировании взвеси. Большинство примесей при этом остается в растворе. После этого остается только снять адсорбированный фермент с твердых частиц адсорбента. Так как степень адсорбции зависит от состава и реакции среды, то, изменяя условия, можно вызвать элюирование фермента, т. е. обратный переход его из осадка в жидкость. Выделение фермента из адсорбента может быть произведено, например, путем промывания осадка раствором фосфорнокислого натрия или калия (с определенным значением pH), водным раствором аммиака и др. Обычно эти операции — адсорбцию и последующую элюцию— пов- [c.126]

Методы получения и очистки ферментов. Ферменты получают обычно путем извлечения их из органов и тканей при помощи воды или глицерина. Если же они оказываются нерастворимыми, то материал тонко измельчают и сохраняют в виде сухого порошка. Следовательно, н вытяжки, и порошки содержат большое количество всевозможных примесей. Чтобы освободиться от низкомолекулярных веществ, например солей, аминокислот, сахаров, вытяжки подвергают диализу. Кроме того, в настоящее время используют фракционированное высаливание, адсорбцию с последующей элюцией, ультрацентрифугирование, электрофорез, а также хроматографическую абсорбцию. [c.339]

В 1913 г. появилась фундаментальная работа Л. Михаэлиса и М. Л. Ментена по ферментативной кинетике. В 1922—1928 гг. Р. Вильштеттер и его ученики, усовершенствовав метод избирательной адсорбции и последующей элюции, достигли блестящих успехов в получении ферментативных препаратов высокой степени очистки. Последние были в сотни и тысячи раз активнее исходных носителей ферментов. Вместе с тем Р. Вильштеттер, добиваясь высокоочищенных ферментных препаратов, на последних стадиях очистки терял какие-то в то время неизвестные вещества (коферменты) и фермент утрачивал свою активность. [c.123]

Как и в случае многих других методов очистки ферментов, единственный способ выяснить, пригоден ли данный метод для такой цели, — это испытать его. Адсорбции способствует низкая концентрация соли, однако необходима достаточная буферная емкость, чтобы предотвратить нежелательные локальные изменения pH вблизи высокополярной поверхности адсорбента. Элюция белков происходит при более высокой концентрации соли. Ее можно добавлять сразу в один прием или, в случае колоночной хроматографии, вводить постепенно в виде градиента. [c.179]

Метод дробного высаливания основывается на признании за ферментами белковой природы. Метод адсорбции впервые был предложен А. Я. Данилевским (1862) и впоследствии разработан Вильштеттером. Он основан на адсорбировании ферментов каолином, глиноземом, гидратом окиси железа, белками, тристеарином, холестерином и другими абсорбентами. Этим способом удается не только очистить ферменты от примесей, но и отде- лить их друг от друга. Так, например, из сока поджелудочной железы, содержащего липазу, трипсин и амилазу, липазу адсорбируют гидратом (жиси алюминия (у-модификация глинозема) трипсин извлекается - -модификацией глинозема, а в растворе остается, главным образом, амилаза. Избирательную адсорбцию дополняют избирательной элюцией, т. е. сниманием фермента с адсорбата различными растворителями при соответственно недобранных условиях. Для этой цели могут быть использованы фосфорнокислые соли. Так, например, из смеси сахаразы и мальтазы, адсорбированных на у - иноземе, сначала полностью элюируется первичным фосфатом 1KH.2PO4) мальтаза. [c.339]

Выделяют ферменты так же, как и другие белки, хотя есть приемы, применяемые преимущественно для ферментов. Из них можно отметить экстракцию глицерином, в котором сохраняются нативные свойства ферментов, а также метод ацетоновых порошков, состоящий в осаждении и быстром обезвоживании при температуре не выше —10° С тканей или вытяжек из них, содержащих ферменты. К их числу относится также получение ферментов путем адсорбции с последующей элюцией (снятием) с адсорбента. Этот метод был введен в химию ферментов А. Я. Данилевским и дал мощный толчок развитию ферментологии. Сейчас адсорбционный метод вьщеления и очистки ферментов разработан детально. Наряду с ним широко применяют метод ионообменной хроматографии, метод молекулярных сит. электрофорез и особенно изоэлектрофокусирование. Oiona из остроумнейших модификаций адсорбционного метода—аффинная хроматография, где адсорбентом служит вещество, с которым фермент взаимодействует избирательно. В результате лишь один этот фермент задерживается на колонке, а все сопутствующие ему выходят с током проявителя. Изменяя характер проявителя, исследуемый фермент элюируют с колонки. Этим методом достигают очистки фермента в несколько тысяч раз, применяя всего лишь одноэтапную (аффинная сорбция—элюция) схему выделения. [c.97]

Первые растворимые препараты ацетилхолинэстеразы из эритроцитов были получены в 1943 г. Менделем и Рэдни [86] экстракцией дистиллированной водой, адсорбцией на кизельгуре и элюцией 0,001 н. раствором NaOH. Растворы фермента обладали активностью, в 20—30 раз большей, чем исходный гемолизат, однако содержали гемоглобин и другие белки. Более совершенные методы [c.164]

Теория адсорбции разрабатьшалась параллельно с этими исследованиями. Этим объясняется частично несовершенство некоторых трактовок процессов адсорбции и элюции, принадлежащих Вильштеттеру и его сотрудникам. В значительной степени объяснения основьгоались на эмпирических данных. В качестве примера можно привести процесс очистки перок-сидазы из хрена, разработанный Р.Вильштеттёром и А.Што-лем (74). В случае пероксидазы Вильштеттеру удалось достичь максимальной эффективности разработанного им метода очистки. Если в случае других ферментов удавалось добиться повышения активности в сотни раз по сравнению с активностью исходного препарата (панкреатическая амилаза [c.137]

Результаты исследований первой половины XIX в. были предпосылкой к разрешению важных проблем во второй половине того же века. Был открыт ряд новых катализаторов животного и растительного происхождения. Ферментативные процессы стали широко применяться в промышленности (получение уксусной кислоты и др.). Среди исследований этого времени особое место по своей значимости занимают работы А. Я. Данилевского, который в 1862 г. впервые применил метод избирательной адсорбции (связывание на поверхности) ферментов с последующей их элюцией (освобождение с поверхности). При обработке экстракта из поджелудочной же.т1езы он отделил фермент амилазу от фермента трипсина. Метод избирательной адсорбции в дальней- [c.121]

Адсорбция — это процесс, обусловленный вандерва-альсовыми силами, электростатическим и гидрофобным взаимодействиями, а также стерическими факторами. Адсорбция индивидуального вещества описывается типичной изотермой адсорбции Ленгмюра, которая представляет собой гиперболу на графике зависимости концентрации растворенного вещества от количества адсорбированного вещества. Такой же кривой описывается и насыщение фермента субстратом, а также закон убывающего плодородия . Поверхностную сорбцию и элюцию неполярных веществ успешно осуществляют с помощью силикагеля, кизельгура, окиси алюминия, фло-рисила и активированного угля. Полярные макромолекулы, такие, как белки и нуклеиновые кислоты, очищают либо методом статической сорбции, либо в условиях колоночной хроматографии с использованием гидрокси-апатита, кальций-фосфатного геля или Су -модификации окиси алюминия. [c.202]

Некоторые ферменты необыкновенно устойчивы к инактивации, вызываемой любым из факторов, описанных в разд. 6.2. Часто это отмечается даже тогда, когда процедура очистки продолжается в течение нескольких недель. Внеклеточные ферменты отличаются большой устойчивостью потому, что 0Н1И существуют в более жестких природных условиях. В таких случаях быстрота операций не имеет большого значения, если решены проблемы протеолитической инактивации. Но в других случаях, когда стабильность фермента не столь велика, скорость опе раций может быть гораздо важнее, чем разрешегаие, достигаемое на каждом этапе, даже если это означает включение дополнительной стадии очистки для окончательного удаления из препарата примесей. При очистке нестабильных ферментов следует исключать диализ и гель-фильтрацию на медленно фильтрующих средах. Если это возможно, то одна стадия фракционирования должна следовать за другой без длительной подготовки. Так, после солевого фракционирования может идти гель-фильтрация, поскольку на этой стадии удаляется соль и в то же время происходит фракционирование белков. Но после солевого фракционирования нельзя сразу же использовать метод ионного обмена. Его можно применять только в исключительных случаях, когда соль, содержащаяся в осадке, не препятствует адсорбции нужного белка. Непосредственно после стадии ионного обмена невозможно использовать гель-фильтрацию, так как фракции нужно сконцентрировать, — очень редко при элюции с ионообменника получается острый пик, содержащий концентрированный раствор данного вещества (см., однако, обсуждение аффинной элюции в разд. 4.4 и х роматофокуси-рования в разд. 4.3). После фракционирования смеси с помощью органического растворителя может следовать ионный [c.266]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология