Библиотеки космидные

При конструировании космидной библиотеки, вероятно, наиболее важное значение имеет качество используемой ДНК-Лишь около трети фрагментов ДНК длиной 40—50 т. п. н., полученных из молекул с исходным размером 100 т.п.н., содержат сайты рестрикции на обоих концах. Разорванные молекулы конкурируют в реакции лигирования, что делает невозможным создание хорошей библиотеки. При выделении ДНК необходимо соблюдать следующее условие на каждой из стадий выделения (частичный гидролиз, градиентное центрифугирование и т.д.) рекомендуется проверять ДНК в 0,2%-ном агарозном геле. Инструкции по применению этих гелей приведены в разд. 2.3.4. Для получения высокомолекулярной ДНК мы используем метод, детали которого описаны в табл. 2.1. Метод этот пригоден при работе со свежими и с замороженными клетками и тканями. [c.44]

Космидный вектор следует предпочесть вектору для клонирования на основе фага X, поскольку при использовании космид для полного перекрывания человеческого генома представительная библиотека должна включать меньшее количество клонов. Необходимое в каждом из случаев количество клонов можно рассчитать, как описано в приложении 9.2 [c.282]

Основным критерием выбора именно космидного вектора должна быть необходимость клонирования очень больших фрагментов ДНК в противном случае всегда легче и быстрей сконструировать фаговую библиотеку. [c.41]

Хранение космидных библиотек [c.56]

З. Упаковка космидной библиотеки с использованием суперинфекции [c.56]

Упакованные таким образом библиотеки могут долгое время храниться при 4°С, и с ними можно работать, используя те же методы, что и в случае обычных космидных или фаговых библиотек. [c.57]

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К КЛОНИРОВАНИЮ, МОДИФИКАЦИИ И ХАРАКТЕРИСТИКЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ КОСМИДНЫХ БИБЛИОТЕК КЛОНОВ [c.74]

Теоретически селекции присуще ограничение предельных размеров, устанавливаемых для рекомбинантов упаковывающей системой к [23]. Однако эти трудности легко обойти, если использовать маленькие (2,9—5 т. п. -н.) плазмиды. Средний размер космидного клона в наших библиотеках составлял 45 т. п. н., и существующий запас размера (до предельного) вполне достаточен, чтобы покрыть прирост размера образующихся продуктов рекомбинации. Кроме того, можно ожидать, что ограничения по размеру, накладываемые одиночным актом упаковки, менее строгие, чем те, которые накладываются повторными упаковками, необходимыми для образования фаговых бляшек [24]. [c.83]

Космидные клоны и клоны библиотек 85 [c.85]

Конструирование космидных библиотек [c.86]

Космидные векторы — плазмиды, несущие os-последователь-ности, распознаваемые компонентами системы упаковки фага X [1], представляют собой удобный инструмент для клонирования и анализа больших фрагментов геномов, картирования хромосом и клонирования генов, размер которых превышает 20 т. п. н. Хотя в настоящее время разработаны приемы, позволяющие конструировать космидные клоны и оперировать с космидными библиотеками, все же неизбел но возникают трудности при получении и анализе больших библиотек, необходимых для клонирования генома млекопитающих в частности, вызывает затруднение введение специфических модификаций во вставки в тех случаях, когда их нельзя прямо увязать с характеристиками рестрикционной карты. Эти трудности могут быть весьма существенными. Во многих случаях для их преодоления используются методы генетики бактерий, позволяющие упростить илп облегчить решение этих задач. [c.74]

Таблица 3.1. Среды и методики высева космидных библиотек

О Ожидаемая частота рекомбинантов, содержащих уникальную последовательность в космидной библиотеке генома млекопитающих, варьирует от 2-10 до 10- в зависн-мости от типа последовательности, ее длины и степени гомологии с зондом. Колонии, которые растут группами, ближе к краю и в складках фильтра, часто бывают фоновыми. Хорошие колонии через 24—36 ч почти прозрачны, неплотные, круглые и имеют коричневатый цвет. [c.93]

Построение контигов из космидных, Р1- и Х-библиотек [c.463]

Более удобными для генетических исследований и широкомасштабного секвенирования часто оказываются контиги из небольших фрагментов ДНК, чем из крупных. Для построения контигов определенных районов хромосом или целых хромосом нередко используют космидные библиотеки. Обычно перекрывающиеся космидные клоны идентифицируют методом геномной дактилоскопии. Для этого из каждого клона экстрагируют ДНК и обрабатывают ее рестриктазой. Полученные фрагменты метят, разделяют при помоши электрофореза и визуализируют радиоавтографическими методами. Каждый клон порождает специфический набор фрагментов - уникальный отпечаток его ДНК у перекрывающихся клонов один или несколько фрагментов совпадают. [c.463]

Альтернативные методы скрининга космидных библиотек, описанные в гл. 3, предполагают селекцию космидных клонов с использованием феномена гомологичной рекомбинации in vivo. Остальные главы книги посвящены вопросам, связанным с экспрессией клонированных генов. Для многих белков млекопитающих удалось осуществить высокопродуктивную внутриклеточную экспрессию в Е. oli. Однако гетерологические белки, локализующиеся в цитоплазме, часто образуют трудно растворимые агрегаты, что значительно осложняет получение нативного продукта. В гл. 4 описаны эффективные способы выделения активных растворимых продуктов из нерастворимых белков цитоплазмы Е. соИ. Вероятность деградации специфическими бактериальными протеиназами многих эукариотических белков, синтезируемых в Е. oli, может быть существенно снижена, если их экспрессировать в виде гибридных белков. Такие составные белки, в которых бактериальный компонент обычно представлен -галактозидазой, можно использовать в качестве иммуногенов для получения антисыворотки и моноклональных антител к клонированному эукариотическому белковому домену. Эти вопросы >ассматриваются в двух главах — одна посвящена получению поликлональной антисыворотки, а другая — методам гибридной технологии. В последующих главах книги описаны современные эукариотические экспрессирующие системы в гл. 7 — дрожжевая, далее в трех главах — системы на основе культивируемых клеток млекопитающих и трансгенные животные. В частности, описана система экспрессии с использованием векторов, которые несут гены, обеспечивающие возможность их индуцибельной амплификации это позволяет снимать токсическое действие антибиотиков, введенных в культуральную среду. Клонированные в таком векторе гены также [c.8]

Идеальный вектор для клонирования ДНК высших эукариот должен обладать как можно большей емкостью, чтобы можно было обойтись меньшим количеством циклов скрининга библиотеки для выделения клонированных перекрывающихся фрагментов крупного гена. В нынешнем поколении векторов наибольшей емкостью обладают космидные векторы, но используют их пока реже, чем векторы, полученные на основе фага %. Объясняется это частично непредсказуемостью поведения космидных векторов, а также существенно большей трудоемкостью методов получения космидных библиотек по сравнению с эквивалентными фаговыми библиотеками. В задачу данной главы входит описание ряда разработанных в нашей лаборатории методик, а также характерных случаев и наиболее распространенных ошибок, мешающих созданию полноценной библиотеки. Мы должны подчеркнуть, что техническая сложность проводимых экспериментов затрудняет детальный анализ всех аспектов космндного клонирования. Составленный нами свод методик должен рассматриваться лишь как руководство и допускает возможные отклонения. Однако следует иметь в виду, что не имеющие большого опыта исследователи не должны серьезно от них отклоняться до тех пор, пока не приобретут сами достаточного навыка, чтобы позволить себе импровизировать. [c.40]

Вырастите 100 мл космидной библиотеки в L-среде в присутствии антибиотика и 10 мМ MgSOi. Внесите достаточно бактерий, чтобы получить исходно Лбоо около 0,08, Выращивайте клетки при энергичной аэрации до Лбоо=0,4. Это может произойти быстро (2 ч) или гораздо медленнее (>4 ч). [c.57]

Индукция профага приводит к упаковке космиды Кт , но не плазмиды Ар Однако если между фрагментами ДНК, клонированными в космиде и в плазмиде, имеется гомология, то между гомологичными последовательностями может с частотой 10 произойти рекомбинация, в результате которой оба вектора объединяются в одну крупную кольцевую космиду. Только в этом случае упаковка обеспечит возможность трансдукции обоих маркеров Д /п и Лр . Поэтому для клонирования какого-либо гена достаточно лишь вставить небольшой фрагмент его ДНК в плазмиду-зонд, содержащуюся в линии хелперных клеток, суперинфицировать их космидной библиотекой (упакованной, как указано в разд. 2.2.8.5), индуцировать профаг в хелперных клетках и высеять их на чашки с Km и Ар. Колонии с двойной лекарственной устойчивостью должны в принципе содержать ген, клонированный в космиде, в которую интегрировала плаз-мида-зонд. [c.62]

Настоящая глава посвящена генетическим подходам к выделению, генноинженерному манипулированию и анализу индивидуальных космидных клонов или библиотек клонов. В ней представлены методики упаковки космидных клонов в лямбо-доидные фаговые частицы и отбора нужных космид (или плазмид) из полных библиотек путем гомологичной рекомбинации. Рассмотрены также способы модификации отобранных клонов или групп клонов с помощью вставок или замещений определенных последовательностей. [c.74]

Упаковку космид in vivo можно применять при многих видах работ с космидными клонами и библиотеками. Основное достоинство данного подхода при амплификации библиотек — простота работы с упакованными космидами. Как и библиотеки, полученные на основе Я-векторов, космиды хорошо хранятся при 4 °С в виде фаговых суспензий, что позволяет легко оттитровать космидный препарат. При комнатной температуре препарат стабилен и хорошо выдерживает транспортировку. [c.76]

Амплификация перед упаковкой in vivo, подобно любой амплификации библиотеки, чревата уменьшением представленности библиотеки и может привести к повторному выделению идентичных клонов. Как и в других случаях, этот риск может быть снижен раздельной амплификацией и упаковкой независимых фракций космидной библиотеки. [c.76]

Третье достоинство упаковки in vivo — возможность использования ее для избирательного и высокоэффективного переноса космид между различными штаммами-хозяевами. Проводя последовательные циклы упаковки и повторного инфицирования, космиды ила космидные библиотеки можно легко (и избирательно) переносить между штаммами-хозяевами с различным генотипом при этом космиды будут постоянно или временно подвергаться воздействию других генетических элементов (плазмид, транспозонов). Поэтому упаковка in vivo представляет собой важный этап многих подходов к генетическим манипуляциям с [c.76]

Главное условие для проведения экспериментов по космид-но-плазмидной рекомбинации — это отсутствие гомологии в последовательностях обоих векторов, так как это исключит возможность их гомологичной рекомбинации между иими. Кроме того, необходимо ввести космидную библиотеку, исходно сконструированную и амплифицированную в г< сЛ"-клетке, в полноценный по рекомбинации штамм, несущий селективную плазмиду (плазмиды). Наконец, необходимо обеспечить возможность селекции рекомбинантных космид после их повторного переноса в гесЛ -хозяина с тем, чтобы убедиться в стабильности клонов при их дальнейшем размножении. [c.78]

Принцип метода схематически показан на рис. 3.2. Космидные библиотеки, сконструированные в гесЛ -клетке, упаковывают в Я-частицы, чтобы получить лизат с высоким титром трансдуцирующих частиц. Аликвоты упакованной библиотеки используют затем для заражения гес+-клеток, в которые предварительно введена последовательность (или последовательности) -зонд, клонированная в плазмиде, не имеющей гомологии с космидным вектором. Через 30 мин — 2 ч, в течение которых должна произойти рекомбинация, космиды вновь упаковывают в фаговые частицы. Упакованные космиды используют для заражения гесЛ -хозяина, проводя селекцию по обоим маркерам лекарственной устойчивости — плазмидному и космидному. Поскольку плазмида не несет os-последовательностей, она будет перенесена в реципиентные клетки только в случае рекомбинации с гомологичной последовательностью в космидном клоне. Для того чтобы восстановить исходную космиду, можно вновь разделить два клопа в результате второго рекомбинационного события и после переноса в нового хозяина идентифицировать ревертантов на индикаторных чашках. Как будет сказано ниже, точное восстановление, однако, не всегда возможно (или желательно). [c.78]

Как сказано выше, приведенные здесь методики используются для отбора уникальных космидных (или плазмидных) клонов из больших библиотек с применением генетической селекции, а не скрининга библиотек путем гибридизации колоний. Этот подход получил широкое распространение использование в качестве селекционных зондов последовательностей, клонированных в pU 8 и pU 9, позволяет выделить многие космидные клоны из библиотек мыши и человека (см., например, [5, 6, 22]). [c.82]

Представляется возможность не только отбирать специфические космидные клоны из космидных библиотек, но и использовать специфические космиды для выделения клонов из сложных плазмидных библиотек. Этот подход можно использовать и для выделения клонов кДНК, содержащих последовательности, кодируемые вставочным фрагментом данного космидного клона. [c.84]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология