ДСН—ПААГ обнаружение

Впервые окрашивание комплексами серебра разделенных в электрофоретических гелях белков было применепо в 1972 [197], по потенциальные возмож1ЮСти этого метода были открыты позднее [359]. Методы окрашивания белков комплексами серебра в 100—200 раз более чувствительны, чем основанные на применении кумасси бриллиантового голубого. Из шести предложенных методик с этим реагентом наилучшие характеризовались пределом обнаружения 0,5 нг белка/мм поверхности ПААГ [282]. Чувствительность окрашивания комплексами серебра несколько варьирует в зависимости от свойств и природы белка, как показано в сравнительном исследовании четырех различных методик применительно к белкам секрета околоушной железы человека, причем выбор оптимального варианта [c.302]

Чувствительность метода обнаружения нуклеиновых кислот в гелях с помощью бромистого этидия очень высока в гелях агарозы легко удается наблюдать полосы, содержащие 0,01 мкг ДНК, а в ПААГ — доли микрограмма. Рабочая концентрация водного раствора красителя при окрашивании нуклеиновых кислот в гелях составляет около 1 мкг/мл. В таком растворе гель вымачивают в течение 0,5—1 ч или же вводят бромистый этидий в рабочий буфер геля при его полимеризации. [c.150]

Во всех описанных способах белки перед окрашиванием или в его процессе фиксируют осаждением кислотой и спиртом. Однако некоторые основные белки (например, рибонуклеаза и протамин), а также низкомолекулярные пептиды и гормоны при такой обработке не осаждаются, а, наоборот, растворяются и вымываются из геля. Недавно был предложен принципиально иной подход к фиксации белков и пептидов в геле после электрофореза. Гель в течение 1 ч вымачивают в 5%-ном растворе формальдегида в 25%-НОМ этаноле с добавлением СВВ R-250 до 0,11%. В этих условиях формальдегид ковалентно сшивает пептиды с матрицей геля за счет образования метиленовых мостиков между аминогруппами аминокислот и первичными аминами ПААГ. На приведенных в работе фотографиях можно видеть разительный эффект обнаружения щелочных и низкомолекулярных белков гели, кажущиеся пустыми при обычном окрашивании, на самом деле содержат множество белковых полос. Гели с ДДС-Na красят более продолжительное время (до 3 ч) в 3,5%-ном рас- [c.93]

Обнаружение и локализацию белковых зон после их разделения электрофорезом в ПААГ в большинстве случаев осуществляют путем их прокраски в геле. Зоны проявляются как окрашенные полоски или пятна различной интенсивности, в зависимости от содержания в них белка. Для окраски гель вымачивают в растворе красителя, который диффундирует внутрь него и прочно связывается с белками. Процесс диффузии, как правило, занимает несколько часов. Во избежание размывания полос за это время белки иногда предварительно фиксируют осаждением. Для этого гель сначала вымачивают в 10%- или 50%-ной трихлоруксусной кислоте (ТХУ). Чаще фиксацию совмещают с окрашиванием, используя раствор красителя в. смеси уксусной кислоты и метанола или в ТХУ. [c.88]

Для обнаружения нуклеаз при полимеризации геля в него вносят ДНК (10 мкг/мл) или РНК (25 мкг/мл). Если нуклеазы для своего действия нуждаются в ионах Mg " , Са " или то в их растворе ПААГ вымачивают после окончания электрофореза. Далее следует окрашивание геля красителем для нуклеиновых кислот—бромистым этидием (см. главу 4). Окрашивается весь гель, за исключением полос, содержащих нуклеазы, где нуклеиновая кислота разрушена. Можно вести разделение нуклеаз и в присутствии ДДС-Na, блокирующего их действие во время электрофореза. Перед обработкой бромистым этидием ДДС-Na из геля вымьюают. [c.103]

Присутствие ММФ в препаратах НАД-киназы из скелетных мышц кролика было продемонстрировано также при фракционировании на колонке с сефадексом С-200 (3), а значения молекулярных весов олигомеров фермента были уточнены с помощью метода электрофореза в линейном градиенте концентрации полиакриламидного геля (ПААГ) [16]. Результаты, полученные при исследовании фермента двумя указанными методами, показали, что в частично очищенных препаратах НАД-киназы присутствуют олигомеры фермента с молекулярными весами 31000, 65000, 94 ООО, 60 ООО, 220 ООО, 350 ООО. Наименее ассоциированной формой НАД-киназы является белок с молекулярным весом 31 ООО, который, по-видимому, можно считать субъединицей фермента на том основании, что после обработки додецилсульфатом натрия двух низкомолекулярных фракций, снятых с колонки (31 ООО, 5 000), и последующего электрофореза на электрофореграммах не был обнаружен белок с молекулярным весом, меньшим 30 ООО. [c.138]

В рассмотренном методе обнаружения антигенов после электрофореза в ПААГ путем их диффузии в слой агаройы иммунная реакция следовала за окончанием этой диффузии, когда снятую с ПААГ агарозную реплику вымачивали в специфической антисыворотке. Два процесса можно совместить во времени, если антисыворотку заставить диффундировать в гель навстречу диффузии антигена из белковых зон, полученных в результате электрофореза [Grabar, Williams, 1953]. При этом можно ожидать образования полос преципитации комплексов антиген — антитело, подобно тому как это имеет место при двойной радиальной иммунодиффузии по методу Ухтерлони. Для удобства наблюдения раствор антисыворотки следует заливать не сверху, а рядом с треком электрофореза, на некотором расстоянии от него, с тем чтобы оставалась свободная полоса ПААГ, где и будет происходить диффузия антигенов и антител навстречу друг другу. Поскольку расположение полос антигенов после электрофореза заранее неизвестно, антисыворотку, очевидно, придется заливать не в лунку, а в канавку, идущую вдоль всего трека. Кроме того, антисыворотку следует вносить в такую канавку только после окончания электрофореза, иначе преждевременная диффузия антител в гель может помешать завершению процесса электрофоретического фракционирования смеси белков. [c.134]

Не очень чувствительные, но быстрые и простые методы позволяют обнаружить полосы белка после электрофореза в присутствии ДДС-Na по осаждению этого детергента. Наиболее простой способ состоит в охлаждении геля до температуры 0—4°. При боковом освещении на фоне черного бархата непрозрачные белковые полосы и пятна хорошо видны среди почти прозрачного геля. По-видимому, комплексы белок—ДДС-Na служат ядрами конденсации большого количества мицелл ДДС-Na, растворимость которого очень сильно зависит от температуры. При отогревании геля полосы и пятна исчезают. Нижний порог чувствительности этого метода — 0[j2 мкг белка на 1 мм площади пятна [Walla e et al., 1974]. Попутно отметим недавно описанный, аналогичный способ обнаружения белков в ПААГ, содержащем 8 М мочевину. Гель выдерживают 5—10 мин при —70°. В местах расположения белковых зон за счет связывания части свободной воды белками мочевина кристаллизуется, давая непрозрачные полосы. Остальной гель при этом остается прозрачным [Ba hra h, 1981]. [c.104]

ДЛЯ обнаружения белков на ПААГ после изоэлектрофокусирования, поскольку носители-амфолиты (полиаминополикарбоно-вые кислоты) реагируют с красителем. Для преодоления этих ограничений было предложено использовать коллоидные суспензии кумасси К250 и 0250 в хлорной [311] и трихлороуксусной [26, 313] кислотах. Приведенная ниже методика дает хорошие результаты. [c.305]

Метод применим к ПААГ-системам, содержащим ДСН и 8 М мочевину. Полипептиды и белки (М 1665—68 000) с изоэлектрическими точками при pH 2,2—10,2 были разделены изоэлектрофокусированием в градиенте pH 3,5—10,5. Чувствительность обнаружения для тридекапептида а-меланостимулирующего гормона составила 20 мкг. [c.305]

Для обнаружения гистонов на ПААГ была использована следующая методика. [c.305]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология