Окрашивание нуклеиновых кислот

Окрашивание нуклеиновых кислот по Фельгену—специфическая реакция, широко применяемая гистологами и цитологами для окрашивания клеточных ядер и хромосом. Реакция Фельгена основана на том, что продукты неполного гидролиза ДНК восстанавливают цвет основного фуксина, обесцвеченного сернистой кислотой. Для осуществления этой реакции тканевой срез после удаления воды помещают в 1 н. раствор соляной кислоты и выдерживают в этом ра,створе при температуре 50—60° С в течение [c.64]

ОКРАШИВАНИЕ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ПОСЛЕ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА [c.150]

Чувствительность метода обнаружения нуклеиновых кислот в гелях с помощью бромистого этидия очень высока в гелях агарозы легко удается наблюдать полосы, содержащие 0,01 мкг ДНК, а в ПААГ — доли микрограмма. Рабочая концентрация водного раствора красителя при окрашивании нуклеиновых кислот в гелях составляет около 1 мкг/мл. В таком растворе гель вымачивают в течение 0,5—1 ч или же вводят бромистый этидий в рабочий буфер геля при его полимеризации. [c.150]

Хорошими красителями для нуклеиновых кислот являются галлоцианин (или оксазин) и толуидиновый синий, Галлоцианин с хромовыми квасцами дает соединение краплак-катион, которое с фосфатными группами нуклеиновых кислот образует соли темно-синего цвета. Чтобы исключить влияние белков, окрашивание нуклеиновых кислот нужно вести при pH 1,5—1,6. [c.92]

Особый интерес представляет взаимодействие нуклеиновых кислот с некоторыми полициклическими ароматическими (основными) красителями, катионы которых имеют плоское строение. Примером таких соединений могут служить акридины (профлавин, акридиновый оранжевый и т. д.). Красители этого типа уже давно используются для окрашивания биологических объектов. Избирательно связываясь с ДНК или РНК, они переводят их в видимую форму. Этот эффект легко наблюдать по поглощению или флуоресценции красителей. В последнее время такие красители приобрели исключительно важное значение как мутагены, обладающие селективным действием, а именно способностью вызывать вставки или делеции (т. е. включение или выпадение единичных нуклеотидов) при репликации ДНК и таким путем специфически подавлять эту репликацию (см. стр. 492). [c.148]

Органическими красителями пользуются не только для идентификации, но также для количественных определений биологических объектов. Так, фуксинсернистая кислота, метиловый зеленый, галлоцианин применяются для количественного гистохимического определения нуклеиновых кислот путем окрашивания исследуемого материала и последующего фотометрического измерения интенсивности окраски. [c.56]

Это доказывается, в частности, интенсивным окрашиванием веретена во время митоза 8Н-реагентами, тогда как в интерфазе реакция окрашивания отрицательна. Следовательно, содержание 8Н-групп периодически изменяется и перед формированием веретена достигает минимума. При связывании глутатиона белки, содержащие 5Н-группы, утрачивают защиту. В результате, в частности, подавляется система дегидрогенизации лимонной кислоты и весь липидный обмен. Как и карбаматы, тиокарбаматы нарушают синтез белков и нуклеиновых кислот, в том числе синтез РНК в процессе митоза. [c.35]

Появление более тонких методов исследования субклеточных компонентов в первые десятилетия этого века позволило выяснить локализацию обоих типов нуклеиновой кислоты (ДНК и РНК) в клетке. Было обнаружено, что именно ДНК является тем веществом, которое обусловливает то характерное окрашивание части ядра гистологическим красителем, на основании которого эта часть ядра была первоначально названа хроматином . Дальнейшее исследование показало, что ДНК действительно является главной составной частью хромосом, в которых она связана с белком, масса которого в хромосомах в три-четыре раза превышает массу ДНК. В отличие от ДНК, которая обнаруживается главным образом в ядре, основная масса РНК локализована в цитоплазме. Однако небольшая часть клеточной РНК находится в ядре. Она сосредоточена там в ядрышке, которое характеризуется чрезвычайно высокой концентрацией РНК. [c.44]

Прямое денситометрическое определение. Анализируя результаты разделения белков и нуклеиновых кислот, часто упускают из вида возможность прямого сканирования гелей с помощью спектрофотометров. Этот метод отличается быстротой, позволяет проводить в процессе электрофореза повторное сканирование гелей через определенные промежутки времени для получения данных об электрофоретической подвижности исследуемых веществ и дает возможность избежать повреждения гелей при извлечении их из трубок. Недостатки метода заключаются в том, что его чувствительность (по отношению к белкам) в 2—3 раза ниже по сравнению с методом окрашивания, а также в том, что он требует [c.267]

Окрашивание белков обычно приводит к их денатурации и не позволяет получать точные количественные данные. В связи с этим были предприняты попытки выявлять белки и нуклеиновые кислоты по поглощению ими ультрафиолетового света. К тому же методы обнаружения нуклеиновых кислот в ультрафиолетовом свете, а белков по флуоресценции, как правило, более чувствительны, чем методы, основанные на связывании макромолекул с красителями. [c.181]

Для белков коэффициент экстинкции при 280 нм намного ниже, чем соответствующая величина для нуклеиновых кислот при 260 нм, и зависит от содержания в белках тирозина и триптофана. Поэтому определение белков в УФ-свете по поглощению при 280 нм представляет собой менее чувствительную процедуру, чем методы окрашивания (рис. 70), К тому же для количественной оценки получаемых данных необходимо учитывать, что разные белки имеют неодинаковые коэффициенты экстинкции. Без построения специальных калибровочных кривых денситометрия в УФ-свете не позволяет производить прямое количественное сравнение кривых различных белковых зон. С помощью отдельных денситометров можно выявлять до [c.182]

Описан быстрый метод окрашивания для обнаружения нуклеиновых кислот после их разделения в разбавленных полиакриламидных гелях [1209]. Гели погружают на 2 ч в смесь равных объемов 2%-ной уксусной кислоты и 90%-ного этанола, а затем переносят в 1%-ную уксусную кислоту, содержащую 0,3% толуидинового синего. Через 4 мин гели промывают 2%-ной уксусной кислотой, содержащей 10% глицерина. [c.385]

Если нуклеиновую кислоту фракционируют в отсутствие БЭ, окрашивание можно провести после электрофореза, поместив гель иа 30 мин в раствор, содержащий 5 мкг/мл БЭ. Для снижения фонового свечения, вызванного присутствием несвязавшегося БЭ, следует промыть гель в течение 30 мин в буфере для электрофореза или в дистиллированной воде. Примечание длительная промывка может привести к исчезновению слабых зон. [c.286]

Нуклеиновые кислоты Окрашивание Метиловым зеленым— [c.57]

Применение. В гистохймии в качестве реактива на дезоксирибозу и рибозу нуклеиновых кислот [1]. Метод дает совершенно отчетливое и различное окрашивание нуклеиновых кислот растительных тканей, однако, результаты, получаемые при исследовании тканей животных, не являются удовлетворительными [Пирс, 176]. В аналитической химии в качестве реактива на Ое, 8Ь, Мо, Зп, Та, N1), и, Т1, 2г, Введен в рациональный ассортимент органических реактивовг на неорганические ионы для определения германия (2, 3) и сурьмы [4, 5] спектрофотометрическим методом. [c.410]

Окрашивание нуклеиновых кислот — методические приемы, позволяющие изучать локализацию и содержание нуклеиновых кислот в индивидуальных клетках. Поскольку нуклеиновые кислоты обладают сильнокислыми свойствами, то они характеризуются высоким сродством к основным красителям — толуидиновому синему, целестиновому голубому, метиловому зеленому и пироиину. Тканевые срезы, легко окрашиваемые такими красителями, получили название базофильных. [c.64]

Пикок и Дингман [983] сравнили несколько основных красителей. Они обнаружили, что толуидиновый синий О, тионин и азур А не менее пригодны для окрашивания нуклеиновых кислот, чем метиленовый синий, который обычно использовали эти авторы. Окрашивание пиронином У, акридиновым оранжевым, алциановым голубым 8 GX, метиловым зеленым и галло-цианином в применявшихся авторами условиях давало менее удовлетворительные результаты. [c.384]

Для окрашивания нуклеиновых кислот используют также 0,27о Ный раствор толуидинового синего О в 7—10%-ной уксусной кислоте. Обесцвечивания можно добиться путем повторных промываний геля в уксусной кислоте или с помош ью электрофореза 704, 852, 1268]. Редди и Блэк [1067] показали, что для окрашивания двухцепочечных вирусных РНК этот краситель подходит больше, чем метиленовый синий или галлоциановый алюмохром. [c.385]

Происходившее в то время бурное развитие химии анилиновых красителей, последовавшее за открытием Вильямом Перкиным мовеина в 1856 г., стимулировало систематическое исследование окрашивания биологических образцов. В общем, было установлено, что ядра клеток глубоко прокрашиваются красителями основного характера. Это свойство привело Флеминга к введению термина хроматин для обозначения вещества ядер клеток, из которого был получен нуклеин [7]. Эта работа привела к открытию похожих на палочки сегментов хроматина, наблюдаемых только в критических состояниях процесса деления клетки. Было выдвинуто предположение, что эти сегменты являются носителями наследственного материала и для них было принято название хромосомы [8]. Прямая связь между этой цитологической работой и исследованиями Мишера была понята Вильсоном [9] В настоящее время известно, что хроматин близко подобен, если не идентичен субстанции, известной как нуклеин (С29Н49ЫэРз022, в соответствии с данными Мишера), анализы которого показывают достаточную точность химического соединения нуклеиновой кислоты и альбумина. И таким образом, мы подошли к замечательному выводу о том, что наследственность может, вероятно, реализовываться в результате физической передачи особого соединения от родителя к потомку . [c.33]

Распространение в природе. Пурины аденин (6.4) и гуанин (6.5) встречаются у всех организмов, будучи компонентами нуклеиновых кислот и нуклеотидов. Гуанин является также одним из пуринов, участвующих в формировании и распределении окраски у животных, мочевая кислота (6.6) также чрезвычайно широко распространена, тогда как ксантин (6.7) и изогуанин (6.8) встречаются реже. Эти пурины не поглощают видимый свет, но для них характерно сильное поглощение в УФ-свете, и поэтому некоторые животные, главным образом насекомые, могут их видеть. Пурины вносят важный вклад в окрашивание животных благодаря своему участию в формировании структурной окраски, особенно белого и сереб- [c.225]

Выделение дезоксирибонуклеопротеида и определение дезоксирибо нуклеиновой кислоты. Дезоксирибонуклеопротеид с дифениламином при нагревании дает синее окрашивание в результате гидролиза и освобождения дезоксирибозы, которая и реагирует с дифениламином. Рибоза с дифениламином образует продукты реакции, окрашенные е зеленый цвет. [c.60]

Небольшое количество нуклеопротеида (лучше чистой нуклеиновой кислоты) смешать с 4 жл ледяной уксусной кислоты и нагревать непродолжительное время. Затем постепенно добавить ]0—15 капель концентрированной серной кислоты, содержащей 0,01 % закисного сернокислого железа. При наличии дезо-, ксисахара после осторожного нагревания раствор дает зеленоватое переходящее в пурпурно-синее окрашивание. [c.182]

Применение. В электронной микроскопии в качестве красителя для контрастирования [I—4], в частности для дополнительного окрашивания с целью кон трастирования нуклеиновых кислот в исследуемых препаратах [5]. В аналИ тической химии в качестве реактива на уксусную и Лропионовую кислоты, Технические показатели (по ТУ 6-09-3196—73) [c.202]

Применение. В микроскопии для гистологических исследований и в качестве красителя для флуоресцентной микроскопии, в том числе для окрашивания ядер по Майеру [Ромейс, 167] для грубого-дифференцирования нуклеиновых кислот [1] для определения изоэлектрической точки фиксированных спиртом тканевых срезов [2] для выявления сульфата декстрана [3] для прижизненного окрашивания гипосульфитной лейкобазой по Роскину и Масловой в смеси с эозином и оранжевым Ж для множественной окраски обзорных препаратов как заменитель тионина и метиленового голубого. [c.391]

Применение. В гистохимии в качестве красителя для выявления основных и кислых белков в кислых растворах при pH 1,4—2,1 нуклеиновые кислоты окрашиваются в.синий цвет, а основные белки —в красный цвет [Пирс, 79, 290] при окрашивании депарафинированных срезов в ортофосфорной или лимонной кислоте ядер ный хроматин окрашивается в темно-синий со стальным оттенком цвет, а ацидофильные тканевые компоненты —в различные оттенки красного цвета [Пирс, 708]. В микроскопии для выявления алюминия, отложения которого окрашиваются в розоЕГ й или красный цвет [Пирс, 874]. В аналитической химии реактив на алюминий и фториды. [c.455]

Для зонного электрофореза ацетатцеллюлозную мембрану (САМ) первым использовал Кон [51]. По мнению Кона, преимущества этого носителя — его однородность и строго определенная пористость. САМ содержит пренебрежимо малое число ОН-групп, загрязненность органическими и неорганическими примесями также весьма мала. В тех случаях, когда сильная сорбция может приводить к образованию на бумаге полосок сзади зон (как, например, при электрофорезе биополимеров) важным преимуществом становится пониженная сорбционная активность САМ. В отличие от бумаги САМ позволяет получить хорошее разделение агфракции сывороточного альбумина, а также инсулина, фибриногена, гистонов, лизоцимов, глико- и липопротеинов и нуклеиновых кислот. После электрофореза меченых соединений остаточная радиоактивность между зонами и стартом исключительно мала. Обесцвечивание фона, если обнаружение проводится путем окрашивания и последующего обесцвечивания, происходит достаточно быстро. [c.293]

Полиакриламидный гель наименее химически активен. Его> слабое сродство к красителям позволяет осуществлять быстрое обнаружение биополимеров, главным образом белков, нуклеиновых кислот и продуктов их деградации, с помощью окрашивания. Прозрачный полиакриламидный гель обладает хорошими механическими свойствами, допускающими изменение концентрации полиакриламида в самых широких пределах. Электроос-мотические эффекты в этом геле очень малы. Условия аналитических и препаративных разделений на полиакриламидном геле путем зонного электрофореза в гомогенных и дискретных системах буферных растворов [48, 77], а также изотахофореза и изо-электрического фракционирования хорошо изучены. [c.299]

В рекомбинационной ДНК-технологии фрагменты нуклеиновых кислот, вырабатываемых при обработке двухнитевой ДНК ограниченными эндонуклеазами, выделяются электрофоретически на агаровых или полиакриламидных гелях. Окрашиванием этидиумбромидом добиваются того, что выделенные ленты становятся видимыми. Затем ДнК денатурируется обработкой щелочью и помещается в буферный раствор. Ленты ДНК переносят на нитратцеллюлозные мембраны тампоном по методике, называемой Сазенов-ским переносом [16]. После окончания переноса и термофиксации нуклеиновых кислот процедура гибридизации выполняется, как описано выше. [c.88]

Гистохимические методы, при помощи которых можно отдифференцировать рибонуклеотиды от дезоксирибонуклеотидов, основаны на обработке клеток рибонуклеазой. До обработки клеток рибонуклеазой выявляют при помощи окрашивания или ультрафиолетовой микроскопии места расположения обеих нуклеиновых кислот. После обработки рибонуклеазой те же методы обнаруживают в клетках только не доступную действию рибонуклеазы дезоксирибонуклеиновую кислоту [62]. [c.392]

Нуклеиновые кислоты, как и белки, необходимы для жизни. Они представляют собой генетический материал всех живых организмов вплоть до самых простых вирусов. Название нуклеиновые кислоты отражает тот факт, что локализуются они главным образом в ядре (nu leus — ядро). При специфическом окрашивании на нуклеино- [c.139]

С помощью специализированных приборов — цитоспектрофотометров измеряют под микроскопом оптическую плотность исследуемого вещества в клетке либо за счет его естественного поглощения (УФ-цитоспектро-фотометрия нуклеиновых кислот и белков), либо после окрашивания препарата стехиометрическим красителем на данное вещество (цитоспектро-фотометрия в видимой области спектра). [c.141]

Не меньшей популярностью пользуется в настоящее время и метод электрофореза в полиакриламидном геле. Добавляя к раствору акриламида, налитому в стеклянные трубки, различные количества мономеров (например, метиленбисакриламид, этилендиакрилат), образующих в процессе полимеризации поперечные сшивки, можно получить гели с различной степенью связанности [137, 404]. Устойчивость к денатурирующим растворителям, например к 8 М раствору мочевины или 1 %-ному раствору додецилсульфата натрия, составляет еще одно важное преимущество этих гелей. При наложении разности потенциалов белки, пептиды, нуклеиновые кислоты и вирусы передвигаются в этих гелях на характерные расстояния, которые зависят главным образом от их молекулярного веса (или веса частицы), а также от степени связанности сшивок геля. Разделившиеся вещества образуют характерные полосы, которые можно выявить либо с помощью методов окрашивания или локального осаждения, либо (в случае разделения радиоактивных веществ) с помощью метода радиоавтографии (см. гл. XI, разд. Б). Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле такова, что с помощью этого метода можно обнаружить и идентифицировать приблизительно 37 видов рибосомных белков [508]. То, что разделение белка на многочисленные полосы происходит в силу действительного различия между белками, а не в результате каких-то артефактов, теперь уже не вызывает солшений. Однако известно, что разделяться на отдельные полосы могут не обязательно совершенно различные вещества, но и такие близкие между собой вещества, как, например, один и тот же белок, у которого часть молекул содержит одну лишнюю амидную (— СО — NH2 С00 ) группу, а другая часть — ацетильную (—NH+— NH — СОСН3) группу [136]. С помощью электрофореза в полиакриламидном геле [c.61]

В некоторых случаях, например когда в результате длительной очистки удается получить лишь очень малые количества материала ИЛИ при необходимости исследовать компоненты отдельных клеток, приходится прибегать к микроварианту электрофоретического разделения белков и нуклеиновых кислот. В то же время микроанализ в полиакриламидном геле сам по себе обладает рядом преимуществ. Так, более короткое время, затрачиваемое на проведение электрофореза, а также на окрашивание и обесцвечивание гелей, делает применение микроанализа целесообразньгм даже тогда, когда материала вполне достаточно для макроварианта. Микрометодика при наличии определенного опыта едва ли намного сложнее обычного диск-электрофореза, хотя требует такого специального оборудования, как микропипетки, микроманипулятор, лупа и микроденситометр. Читатели, интересующиеся деталями этого метода, могут обратиться к монографии Нейхоффа [915], в которой поми мо электрофореза освещены и другие виды работ с микроколичествами материала (гомогенизация, диализ, фотометрия, центрифугирование в капиллярах и т. д.). [c.107]

Галлоцианиновый алюмохром [486] взаимодействует с фосфатными группами нуклеиновых кислот, что приводит к равномерному окрашиванию различных РНК. Метод позволяет проводить и количественное определение разделенных нуклеиновых кислот. [c.385]

Марцинка [815] сравнил несколько красителей, применяемых для выявления нуклеиновых кислот, и сделал вывод, что для окрашивания РНК лучше всего использовать следующий метод. В смеси уксусной кислоты, метанола и воды (1 1 8 по объему) растворяют 0,5% пиронина Y и 1% ацетата лантана. В этом растворе гели выдерживают в течение 16 ч. Обесцвечивание фона проводят путем электрофореза в смеси уксусной кислоты, метанола и воды (1 2 17 по объему) или повторными промываниями гелей в нескольких сменах той же смеси. Окрашенные гели можно хранить в разбавленной уксусной кислоте (3—10%-ной) в течение нескольких лет. Описанный метод позволяет обнаруживать 0,01 мкг РНК. В идентичных условиях толуидиновый синий дает менее чистый фон, а акридиновый оранжевый — менее интенсивную окраску. [c.385]

Бромистый этидий является интеркалирующим агентом и связывается с двухцепочечной нуклеиновой кислотой. Ультрафиолетовый свет, поглощенный бромистым этидием (300 нм) или ДНК (260 нм), но затем переданный бромистому этидию, испускается в виде флуоресценции при 590 нм. Наилучшее окрашивание получается, если перед проведением электрофореза нуклеиновых кислот в гель и в электрофо-резный буфер внести бромистый этидий в концентрации примерно 0,5 мкг/мл. Гель можно окрасить и после окончания [c.111]

Важно не смять материал и не дать ему увянуть, поскольку это влияет на эффективность экстракции и качество препаратов РНК. Повреждение многих типов растительных тканей приводит к быстрому синтезу полифе-иолов (коричневое окрашивание), которые трудно отделить от нуклеиновых кислот. Образование полифенолов можно свести к минимуму осторожным нарезанием и быстрым замораживанием тканей. Кроме того, необходимо иметь в виду, что в результате поранения очень быстро образуются транскрипты, индуцированные стрессом. [c.268]

Фракционирование нуклеиновых кислот путем электрофореза в агарозе — это наиболее удобный метод анализа как ДНК так и РНК. В данной главе изложен метод электрофоретического разделения ДНК, предварительно обработанной рестриктазами. Метод основан на том, что скорость миграции линейных молекул ДНК в электрическом поле пропорциональна их. длине. Таким образом, можно довольно легко разделить фрагменты ДНК разной длины, а также определить размер, сравнивая скорость их миграции в геле с маркерными ДНК известного размера. Полосы ДНК видны при освещении ультрафиолетом после окрашивания геля флуоресцирующим интеркали-рующим красителем бромистым этидием в низкой концентрации. Такой метод окрашивания обладает большой чувствительностью и позволяет обнаруживать зоны, содержащие всего [c.280]

О наличии нуклеиновых кислот в исследуемой ткани свидетельствует положительное окрашивание метиловым зеленым — пиронином. Дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) выявляют с помощью реакции Фёльгена, путем окрашивания метиловым зеленым по Курнику или исследуя УФ-спектры поглощения (265 нм) при контроле с кристаллической дезоксирибонуклеазой (ДНКазой). [c.59]

Фосфатные группы нуклеиновых кислот можно выявлять с помощью таких гистохимических методов, как окрашивание основными красителями, микроозоление и радиоавтография. Наибольшее применение в практике нашел метод окрашивания основными красителями. [c.97]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология