Изоэлектрофокусирование

Изоэлектрофокусирование — один из вариантов электрофоретического разделения макромолекул. Принцип метода состоит в следующем. Если на колонку, вдоль длины которой сформирован градиент pH, нанести образец белка, а потом подключить концы колонки к источнику тока, то молекулы белка будут двигаться по колонке до тех пор, пока не достигнут той области, где величина pH окажется равной величине изоэлектрической точки белка. Для создания градиента pH используются сложные смеси амфотерных соединений, по-разному обозначаемые фирмами-изготовителями (например, амфолины, фармалиты, сервали-ты и т. д.). Эти соединения обычно имеют небольшую молекулярную массу (400—800 Да) и получаются пууем химического синтеза. Общая формула некоторых типов амфолитов может быть представлена в виде [c.98]

Рис. 19. Схема изоэлектрофокусирования на ПАГ-пластинке белков с пероксидазной активностью, выделенных из растений табака, зараженных ВТМ, после хроматографирования на ДЭАЭ-сефадексе А-50

Рис. 3.13. Расположение зон на различных стадиях изоэлектрофокусирования.

Рис. 56. Схематическое изображение колонки для электрофореза в градиенте плотности (фирма IS O модель 210) [464, 465]. Упрощенный вариант, который можно использовать также и для изоэлектрофокусирования. 1 — съемная крышечка для введения градиентного раствора и образца 2— выходная трубка для охлаждающей жидкости 5 —шкала в сантиметрах 4 —полупроницаемые мембраны 5 — верхние электродные сосуды 6 — центральная тефлоновая трубка (внутренний диаметр 1 см) 7—кварцевые окошки 8 — измеритель УФ-света Р —трубка для охлаждающей жидкости 10—шжтл электродные сосуды 11 —шприц, приводимый в движение электромотором

Ионообменная хроматография для фракционирования смеси белков используется значительно реже, чем для их очистки. Большие молекулярные массы обусловливают замедленную диффузию белков в жидких фазах и в связи с этим — невысокую разрешающую способность метода. Для смеси небольшого числа относительно некрупных белков ионообменное фракционирование еще себя оправдывает, однако в более сложных ситуациях оно явно уступает электрофорезу и изоэлектрофокусированию. Приведем несколько примеров фракционирования белков методом ионообменной хроматографии в более или менее благоприятных ситуациях. [c.309]

Посредством изоэлектрофокусирования установлено [183], что изоэлектрические точки (р1) глиадинов находятся в очень широком диапазоне значений pH (в пределах от 5 до 9). Эти значения были подтверждены и уточнены [5], причем выяснилось, что у ш-глиадинов р1 более кислые (между pH 5,5 и 7,0), чем у а-, р- и 7-глиадинов (pH между 6,5 и 8,2). [c.194]

Определение гомогенности выделенного белка кристаллизация (у чистого белка кристаллы одного типа) кривые растворимости (у чистого белка один перелом кривой растворимости) аналитическое ультрацентрифугирование (чистый белок дает один узкий пик) электрофорез в ПААГ, изоэлектрофокусирование (чистый белок дает одну полосу) иммунохимический (чистый белок дает одну полосу преципитации со смесью антител). [c.52]

Определения белок по Лоури, активность по Бояркину. Электрофорез в полиакриламидном геле. Изоэлектрофокусирование на ПАГ-пла-стинках, pH 3,5—9,5. Определение субстратной специфичности, молекулярной массы, ИКС, состава сахаров и др. [c.83]

ИЗОЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЕ, метод разделения и анализа амфотерных в-в, гл. обр. белков, в электрич. поле в среде с изменяющимся в определ. направлении pH. В-ва при зтом смещаются к катоду или аноду до тех пор, пока каждое из них не достигнет зоны, pH к-рой совпадает с его изоэлектрич. точкой, и не сконцентрируется в ней ( фокусирование ). Градиент pH создают, помещая в электрич. поле смесь амфолитов с широким набором изоэлектрич. точек, напр, смесь полиаминов, замещенных в разл. степени карбоксиалкильными группами (т. н. амфолинов). Для стабилизации градиента разделение проводят в вертикальных колонках с градиентом плотности, наполненных сахарозой или глицерином, либо в слоях гелей (полиакриламида, се-фадексов). Метод обладает высоким разрешением и примен. для выделения и очистки от десятков миллиграммов до неск. граммов белков, идентификации (неск. мкг) и анализа их сложных смесей и т. д. [c.216]

При изоэлектрофокусировании белок можно наносить на любую точку предварительно сформированного градиента pH или формировать градиент pH в присутствии белка. В начальные периоды фокусирования электрический ток имеет достаточно большую величину. По мере фокусирования он уменьшается и к концу фокусирования достигает какой-то минимальной величины. Охлаждение обеспечивает получение более четких и узких зон белка. Увеличение времени электрофо-жусирования не сопровождается размыванием белковых зон. [c.99]

Раствор для приготовления геля. Акриламид (24 г) и метилен-бисакриламид (1 г) растворяют в воде и доводят объем водой до 100 мл. Раствор хранят в темной склянке на холоде. При изоэлектрофокусировании необходимо использовать высокоочищен-ные препараты всех реактивов, особенно акриламида. [c.99]

После окончания электрофокусирования гели извлекают из трубок. Часть гелей прокрашивают для выявления белковых зон, а один или два геля используют для измерения градиента pH, сформированного в ходе изоэлектрофокусирования. Существует много вариантов окраски гелей. Один из них состоит в том, что гели погружают на 1 ч в 0,075%-ный раствор кумасси (7-250 в 3,5%-ном растворе НСЮ4. Затем гели 3— [c.101]

Для исследования спектра И. используют ионообменную хроматографию, гель-фильтрацию, электрофорез и изоэлектрофокусирование, а также иммунохим. методы с использованием антител. Наиб, широко используется диск-электрофорез в полиакриламидном геле. Однако применение только этого метода для поиска И. недостаточно, т. к. он не позволяет выявить генетически разл. формы ферментов, не различающиеся по заряду. В связи с этим для более полной характеристики спектра И. необходимо применять иммунохим. аиализ и сравнивать спектры И. мутантов. При выявлении И. необходимо избегать условий выделения, при к-рых возможно возникновение артефактных форм. Так, для предотвращения частичного протеолиза в процессе выделения и хранения работу часто проводят в присут. ингибиторов протеаз. При разделении мембранных ферментов необходимо максимально снижать концентрацию детергента, что позволяет избежать появления новых форм в результате образования мицелл с разным содержанием искомого мембранного фермента. Процедура выделения И. должна быть максимально сокращена по времени. [c.202]

В зависимости от свойств выделяемого фермента и сопутствующих ему балластных веществ при получении очищенных препаратов ферментов комбинируют различные приемы и методы (рис. 4.3), такие, как термическое фракционирование, осаждение органическими растворрггелями, солями и тяжельпли металлами, фильтрация на молекулярных ситах, ионообменная хроматография, электрофорез, изоэлектрофокусирование. [c.80]

В последние годы широкое распространение для фракционирования белков получили различные сочетания изоэлектрофокусирования и диск-электрофореза в полиакриламидном геле —методы двухмерного электрофореза, которые позоляют параллельно анализировать сотни и даже тысячи белковых фракций. [c.32]

В табл. 5.2-5.4 приведены примеры получения гомогенных по данным аналитического изоэлектрофокусирования и (или) электрофореза в полиакриламидном геле эндоглюканаз (см. табл. 5.2), целлобиогидролаз (см. табл. 5.3) и целлобиаз (см. табл. 5.4) из различных микробных источников. Как видно из представленных данных, во всех случаях для получения высокоочищенного фермента требуется 4-6 стадий. Помимо упомянутой выше близости множественных форм эндоглюканаз и других компонентов комплекса по биохимическим характеристикам, сложность и трудоемкость процесса получения очищенных целлюлаз связана с большим количеством примесей белкового (ксиланазы, ламинари-назы, пектиназы, протеиназы, другие белки и ферменты) и небелкового характера. Все это приводит к тому, что для ферментов из каждого, а нередко и из одного продуцента разрабатываются оригинальные схемы очистки. [c.121]

Осаждение этанолом, хроматография на ДЕЛЕ- и ЗР-сефадексе, гель-фильтрация на Сефакриле 3-200 и изоэлектрофокусирование [c.124]

Гель-фильтрация на Сефадексе 0-50, изоэлектрофокусирование на колонке, хроматография на Сефадек-се 0-200 и ДЕАЕ-сефадексе [c.124]

Помимо выделения и очистки, методы ВЭЖХ позволяют быстро и количественно протестировать препараты целлюлаз на микрогетерогенность, поскольку не уступают по чувствительности и разрешающей способности аналитическому изоэлектрофокусированию и электрофорезу [55]. [c.129]

Интересно применение тонкослойной ГёЛь-хромаТо-графии белков в сочетании с техникой изоэлектрофокусирования [199]. [c.118]

Изоэлектрическое фокусирование обладает наивысшей разрешающей способностью, когда-либо достигавшейся при разделении белков цо зар5 дам [58—64, 92]. Этот метод позволяет разделить белки, велйчины р/ которых различаются всего на 0,01 ед. pH. Иногда Для такого разделения бывает достаточно различия между двумя структурами на одну заряженную группу. При помощи метода изоэлектрофокусирования можно также обнаружить другй различия в зарядах, которые, строго говоря, не связаны с макроскопической егомогенностью белков. Вот некоторые из факторов, обусловливающих такие различия посттрансляционная модификация первичной структуры (например, дезамидирование), связывание лигандов, химическая модификация, вариации в небелковых компонентах, например липидах, углеводах и других простетических группах, ассоциация и диссоциация, изменения окислительно-восстановительного состояния металлоферментов. Если при анализе картины изоэлектрофокусирования иметь в виду эти факторы, то полученные данные могут приобрести дополнительную ценность, поскольку в принципе они позволяют обнаружить микрогетерогенность белковых структур. В настоящее время метод изоэлектрического фокусирования применяют в сочетании с другими электрофоретическими методами, например в сочетании с электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, для получения двумерных карт разделяемых компонентов. В одном направлении производят разделение белков в соответствии со значениями их рД а в другом — в соответствии с размерами их молекул, т. е. в соответствии с их молекулярными массами. При помощи этих методов можно охарактеризовать смеси, содержащие тысячи белков [94]. Еще несколько лет тому назад разделение с таким высоким разрешением было просто немыслимо, а в настоящее время этот метод анализа находит все более широкое и все более успешное применение в различных биохимических исследованиях. [c.126]

Однако методом изоэлектрофокусирования на ПАГ-пластинках, содержащих амфолины в диапазоне pH 3,5—9,5, определено 14 белков с пероксидазной активностью (рис. 9). Из них три катионных с изоэлектрическими точками — 9,4 8,7 и 8,0 пять изоэнзимов нейтральных и слабокислых — 7,0 6,7 6,5 6,3 и 5,9 остальные — кислые анионные белки с изоэлектрическими точками — 5,3 5,0 4,5 4,2 4,0 и 3,8. Итак, в составе изопероксидаз растений дурмана преобладают в основном кислые изоэнзимы фермента. Три быстро движущихся изоэнзима содержатся в наибольшей концентрации. Именно для этих пероксидаз из зараженных ХтВК растений интенсивность окраски и скорость проявления с различными субстратами идут всегда быстрее, чем в контроле [Андреева, Омельченко, 1985]. [c.68]

Различия в количестве изопероксидаз, полученные методом электрофореза (рис. 8) и при изоэлектрофокусировании (рис. 9), очевидно, происходят от того, что при электрофорезе некоторые изоэнзимы движутся в электрическом поле вместе и занимают одинаковое положение. Факты эти в литературе описаны. При изоэлектрофокусировании амфолины, входящие в состав геля, способствуют более четкому разделению белковых препаратов, удерживая белки в их изоэлектрических точках. [c.68]

Таким образом, на основании проведенных исследований было показано, что изоэнзимы пероксидазы растений D. stramonium имеют молекулярную массу от 10 до 58 кДа. Методом изоэлектрофокусирования выявлено 14 зон с пероксидазной активностью, следовательно, в составе изопероксидаз, выявленных электрофорезом, присутствует более чем шесть белков. Остальные белки имеют сходный заряд и подвижность в гелях разной концентрации, и их масса укладывается в пределы, идентифицированные методом электрофореза. Различия в молекулярной массе изоэнзимов изучаемого фермента подтверждают его физико-хими-ческую гетерогенность. Выявленные 14 изоэнзимов с различными изоэлектрическими точками, лежащими в пределах pH 3,8—9,4, свидетельствуют о том, что в состав фермента растений D. stramonium входят пероксидазы с различным рН-оптимумом биохимического действия на субстраты. [c.70]

При выделении ферментных белков все этапы очистки должны сохранять фермент в неизменном, приближенном к нативному состоянии. Профиль элюции пероксидазы после разделения на G-100 представлен на рис. 12. В табл. 18 и 19 приведены данные поэтапной очистки и соотношение очищенных препаратов из здоровых и зараженных ВТМ растений табака сорта Ксанти нк. После гель-фильтрации методом изоэлектрофокусирования на ПАГ-пластинках было идентифицировано по 8 изопероксидаз для листьев как вирозных, так и контрольных растений табака. Изоэлектрические точки белков с пероксидазной активностью лежали в широком диапазоне pH — от 3,6, где фокусировался самый кислый изоэнзим, до 9,8 (точка фокусирования самого щелочного изоэнзима). [c.83]

Классические методы исследования мембранных белков, в том числе нейрорецепторов, включают практически все биохимические методы с учетом присутствия детергентов (электрофорез, изоэлектрофокусирование, гель-фильтрация, высокоэффективная жидкостная хроматография, аффинная хроматофа-фия и др.). Основным приемом специфического выделения ничтожно малых количеств нейрорецепторов является аффинная хроматография, которая позволила добиться впечатляющих успехов в изучении молекулярных свойств самых разнообразных типов нейрорецепторов. [c.268]

Наибольщие успехи достигнуты в изучении природы опиоидных рецепторов. Они оказались тесно связанными с липидными компонентами мембран — попытки полного удаления липидов из препаратов рецепторов вели к инактивации. Тем не менее солюбилизация дигитонином позволрша вьщелить частицы с активностью ц- и 5-рецепторов и М = 600-875 кД аналогичным путем полученные препараты к-рецепторов имели М = 300-400 кД. В последующем из мембран, солюбилизированных ультразвуком и тритоном Х=100, удалось вьщелить аффинной хроматографией и изоэлектрофокусированием частицы с М 60 и 45 кД, причем первые обладали опиоид-связывающей активностью, которая приближалась к активности нативных [c.325]

Кох и Бакс 689] сконструировали U-образный лрибор для изоэлектрофокусирования малых количеств белка в градиенте плотности. Этот лрибор (рис. 54) состоит из двух трубок, одна из которых покрыта для устранения электроэ ндоомоса попе- [c.134]

Для изотахофореза белков желательно испольэовать узкие трубки и проводить его в полиакриламидных гелях, не проявляющих по отношению к исследуемым веществам свойства молекулярного сита. Изотахофорез обладает почти таким же хорошим разрешением, как и диск-электрофорез или изоэлектрическое фокусирование. Изо-тахофореграммы белковых смесей очень похожи на картины изоэлектрофокусирования [1116], так как компоненты таких смесей в кислотной системе разделяются главным образом в результате различий в значениях их ИЭТ [501]. Преимущество же изо тахофореза заключается в том, что в отличие от изо- [c.175]

Химический энциклопедический словарь (1983) -- [ c.216 ]

Большой энциклопедический словарь Химия изд.2 (1998) -- [ c.216 ]

Иммунология Методы исследований (1983) -- [ c.76 , c.84 ]

Методы исследований в иммунологии (1981) -- [ c.65 , c.66 , c.120 , c.133 ]

Основы биохимии (1999) -- [ c.97 ]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология