Амфолиты-носители

В настоящей главе рассматривается применение электрофокусирования на синтетических амфолитах-носителях, приводятся основные сведения о методе, даются подробные указания относительно фракционирования белков на препаративном уровне при стабилизации градиента pH с помощью градиента плотности, приводится описание аналитического фракционирования в полиакриламидном геле [c.297]

Швеция) в двух модификациях, имеющих одинаковую высоту, но раз-, личный объем (ПО и 440 мл). Рабочей частью колонки, в которой помещаются амфолиты-носители и создается градиент плотности, является камера, имеющая в поперечном разрезе вид кольца. Нижний электродный раствор обеспечивает контакт с нижним электродом, расположенным в -центральной трубке таким путем достигается отвод газов из электродного пространства без нарушения градиента плотности. Эффективное термостатирование, препятствующее конвекции вследствие возможного нагрева, достигается с помощью внутреннего и наружного холодильников [2 и 3). Внутренний холодильник фиксируется с помощью конического шлифа, расположенного непосредственно под верхним электродом. По окончании фокусирования нижний электродный буфер (в центральной трубке) изолируют от рабочей камеры с помощью крана 6, после чего содержимое камеры сливают через капилляр 7. [c.303]

Синтетические амфолиты-носители [c.303]

Рис. 3. УФ-спектр нефракционированных синтетических амфолитов-носителей (1%-ный раствор) с диапазоном pH 3—10 ( = 1 см).

З.8. Удаление амфолитов-носителей из образца [c.306]

Концентрация амфолитов-носителей [c.309]

Опыты, проведенные при различных концентрациях амфолитов-носителей, свидетельствуют о том, что изоэлектрическая точка белка не зависит от концентрации амфолитов [24]. Обычно работают при концентрации амфолитов 1% (вес/объем), т. е. для работы на колонке объемом 110 мл требуется 1,1 г амфолитов, или 2,75 мл 40%-ного запасного раствора. Работают и при 0,5%-ной концентрации амфолитов, хотя изменение буферной емкости непропорционально изменению концентрации. Более высокое содержание амфолитов (свыше 1%) повышает растворимость белков, склонных выпадать в осадок в изоточке [21]. [c.309]

Второй способ используется при работе с разбавленными образцами однако концентрация солей не должна превышать 0,0005 М. В случае необходимости образец диализуют против воды, содержащей амфолиты-носители.или Г% глицина [27]. [c.310]

Полярность электродов следует устанавливать таким образом, чтобы амфолиты-носители с более высокой электропроводностью попадали в нижнюю часть колонки, где электропроводность понижена из-за высокой концентрации сахарозы. Амфолиты с изоточками в области pH 6—7 обладают сравнительно низкой электропроводностью. Поэтому при работе в области pH ниже 7 вверху помещают катод, а при работе в основной среде вверху находится анод. При фракционировании сырых экстрактов удобно устанавливать полярность таким образом, чтобы примеси накапливались внизу колонки, в особенности если они склонны выпадать в осадок. (Если осадок мешает при сливе колонки, рабочий раствор можно удалить с помощью тонкого шланга, осторожно вводя его через верхний патрубок, см. работу [24].) [c.311]

Существенным недостатком электрофокусирования в градиенте плотности является трудность детектирования амфолитов-образцов в присутствии амфолитов-носителей и сахарозы. Наиболее удобным методом обнаружения служит определение ферментативной активности. Правда, амфолиты-носители могут [c.313]

Определение белка по Лоури в данном случае неприменимо [41], поскольку амфолиты-носители дают сильную реакцию. Удовлетворительные результаты удается получить после диализа или осаждения белка трихлоруксусной кислотой. [c.313]

В конечном счете наиболее удобным методом детектирования белков является определение оптической плотности при 280 нм. Фракции, представляющие интерес, могут быть затем подвергнуты анализу после удаления сахарозы и амфолитов-носителей с помощью диализа. [c.314]

В настоящее время отсутствуют прямые доказательства влияния амфолитов-носителей на р1. Тот факт, что величина р1 не зависит от концентрации амфолитов-носителей [24] и в некоторых случаях от присутствия 6 М мочевины [28], свидетельствует о том, что амфолиты не образуют комплексов с белками. Электростатическое взаимодействие между белком и амфолитами с одинаковыми изоточками должно быть минимальным при плавном электрофокусировании, когда оба компонента имеют нулевой суммарный заряд. Таким образом, любое обратимое взаимодействие белка и амфолита при значениях pH, далеких от их изоточек, не должно сказываться на результатах фракционирования. Однако нельзя совсем исключить возможность комплексообразования. [c.320]

Образец можно вносить при формировании геля или же наслаивать сверху, как в обычном диск-электрофорезе. В первом случае при подготовке рабочего раствора необходимо ввести поправку на объем образца и несколько уменьшить количество воды. Наслаивание образца производится после сборки всего прибора или даже после создания градиента pH предварительным электролизом. Для этого верхнюю часть трубок заполняют 1%-ным раствором амфолитов-носителей в 5%-ной сахарозе. В электродные камеры осторожно заливают электролиты, а затем с помощью микрошприца или тонко оттянутой пипетки наслаивают образец (в 10%-ном растворе сахарозы) на поверхность геля. [c.325]

Зоны белка фиксируют путем погружения геля в 5%-ный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ). Для многих белков этого вполне достаточно, так как вскоре зоны проявляются в виде белых полос. Однако если необходимо окрасить белок, вначале следует удалить амфолиты-носители, поскольку они дают интенсивную окраску с большинством красителей для белка. [c.326]

Ряд вопросов постановки эксперимента при электрофокусировании в градиенте плотности, такие, как выбор температуры, концентрации и рН-диапазона амфолитов-носителей, сохраняют свое значение и при электрофокусировании в геле. Другие аспекты, свойственные только этому методу, требуют специального разбора. [c.327]

Градиент pH создают путем приложения постоянного электрического поля к смеси амфолитов-носителей (амфотерных соединений низкой молекулярной массы с близкими значениями р/). Сами амфолиты-носители фокусируются, т. е. выстраиваются вдоль электрического поля от анода к катоду в порядке возрастания значений р/, формируя таким образом градиент pH и обеспечивая достаточную буферную емкость и проводимость раствора. Так как суммарный заряд белка зависит от значения [c.125]

Более пологий градиент pH можно получить в приборе с большим числом мембран и с применением амфолитов с большим набором изоточек. Амфолит-образец, помещенный в такую систему амфолитов-носителей, мигрирует в область, где его суммарный заряд равен 0. Ряд работ, касающихся разделения таким путем, рассматривается в обзоре Свенссона [И]. В целом здесь достигается слабое разрешение оно ограничено числом перегородок, которые сами по себе вызывают нежелательный эндоосмотический поток электролита. [c.301]

Дополнительный теоретический анализ естественного градиента pH выполнен Свенссоном [9, 12] в 1961 и 1962 годах. Он предложил заменить многокамерный прибор градиентом плотности и описал свойства амфолитов-носителей, пригодных для формирования стабильного градиента pH. Свеиссон рекомендовал использовать низкомолекулярные амфолиты, обладающие буферными свойствами и- проводимостью в изоэлектрической точке . Поиски подходящих носителей показали [12, 13], что доступные амфолиты не вполне пригодны для работы, особенно при pH 4—7. Для этой цели более или менее пригодны смеси пептидов, полученные частичным гидролизом белков, однако их присутствие затрудняет анализ разделяемых смесей [13]. До настоящего времени наиболее удачными амфолитами оказались соединения, которые были специально синтезированы для этих целей. [c.301]

Амфолиты-носители, синтезированные Вестербергом [2, 14], представляют собой гетерогенную смесь различных полиамино-поликарбоновых кислот довольно низкого молекулярного веса. [c.301]

Амфолиты-носители, синтезированные по методике Вестерберга [2, 14], выпускаются фирмой (ЬКВ РгосЗик1ег-АВ (Швеция) согласно нижеприведенной спецификации [c.303]

Для отделения белков от амфолитов-носителей и сахарозы существует ряд методов а) гель-фильтрация на сефадексе или био-геле [123] б) исчерпывающий диализ в течение нескольких суток против разбавленного солевого раствора. Описание аппаратуры для диализа большого числа образцов приводится в работах Раста [22] и Теппана [23] в) ультрафильтрация [124] на мембранах фирмы Аткоп (США) г) осаждение белка сульфатом аммония [125]. [c.306]

Теоретически максимально возможное напряжение обеспечивает наиболее высокое разрешение [см. уравнение (2)]. Однако на практике увеличение напряжения лимитируется возможным нарушением градиента вследствие тепловой конвекции. Неоднократно отмечалось, что для колонки объемом ПО мл предельная мощность составляет 1 Вт, хотя в большинстве случаев реальным пределом является мощность 2 Вт. Удовлетворительные результаты получены и при мощности 4 Вт [39]. На практике о превышении мощности судят по появлению в колонке завихрений, проявляющихся вследствие нарушения коэффициента преломления среды. По мере фокусирования амфолита-образца и амфолита-носителя сопротивление колонки растет, и при необходимости напряжение можно постепенно увеличить (например, начать при 400 В, а затем увеличивать каждый час на 200 В). При работе в широком диапазоне pH конечное напряжение составляет 400—700 В, а при работе в узком диапазоне — до 1000 В. Дополнительным фактором, препятствующим увеличению напряжения, является наблюдаемое на опыте осаждение белка при высоком напряжении, о чем сообщает, например, Джеппсон [29]. [c.312]

Наиболее распространенным методом является определение оптической плотности при 280 нм. Этот метод обладает достаточной чувствительностью, позволяет вести анализ в потоке и не сопровождается потерей вещества. Однако сами амфолиты-носители обладают сильным поглощением при 280 нм, и колебания в оптических свойствах отдельных соединений могут быть ошибочно приняты за зоны белка. Вследствие этого необходимо провести определение нулевой линии, свойственной данной партии амфолитов подобный пример приведен на рис. 4. Отклонение от нулевой линии невелико как при биуретовой реакции,так и при записи поглощения при 280 нм. Фон при 254 нм достаточно велик. Поэтому обычные проточные денситометры, где анализ ведется при 254 нм (линия ртути), непригодны в случае электрофокусирования. [c.314]

На рис. 8 приведена схема прибора для диск-электрофо-реза, подготовленного для электрофокусирования в геле. Находящийся в трубках полиакриламидный гель содержит амфолиты-носители, которые вместе с образцом равномерно распределены по всему гелю или наслоены сверху. Для предотвращения окисления или восстановления амфолитов-носителей (на аноде и катоде соответственно) электроды погружают в раствор кислоты или основания. Во время электролиза кислота благодаря отрицательному заряду сульфат-иона остается в анодном отделении. В кислой среде над слоем геля амфолиты-носители приобретают положительный заряд и вследствие этого стремятся к кётоду. При подаче постоянного напряжения амфолиты распределяются по трубке в порядке их изоточек и фокусируют ам-фолиТы-Образцы в областях, соответствующих их изоточкам. Напротив, в основной среде вблизи катода амфолиты заряжены отрицательно и вследствие этого движутся к аноду. После удаления из трубок гель можно анализировать любыми методами, позволяющими избежать влияния амфолитов-носителей. [c.321]

Для элекгрофокусирования в геле в большинстве случаев вполне достаточно источника питания с напряжением О—400 В и силой тока О—30 мА. Для удаления амфолитов-носителей электрофорезом необходим более мощный источник постоянного тока при электрофорезе в продольном направлении — О—100 В, О—100 мА и при электрофорезе в поперечном направлении— 0—20 В, 0—500 мА. [c.323]

Бумагу использовали в качестве пористой среды для изоэлектрического фракционирования в искусственных градиентах pH [115, 116], однако такая методика не получила распространения, частично из-за трудности создания искусственного градиента pH. Более удовлетворительные результаты получаются при использовании синтетических амфолитов-носителей, дающих естественный градиент pH. По сравнению с гелем бумага более удобна в обращении. Кроме того, здесь легче удалять амфолиты, поскольку белки могут быть подвергнуты тепловой денатурации непосредственно на бумаге к тому же белки легче снимаются с бумаги после фракционирования. Для. окрашивания белков на бумаге в присутствии амфолитов-носителей. применяют водный раствор, содержащий 0,05% бромфенолового синего, 1% хлористой ртути и 2% уксусной кислоты (117] при этом предварительно высушенную в сушильном шкафу электро-фореграмму погружают в горячий 10%-ный раствор ТХУ. Интенсивность окраски можно увеличить, выдерживая высушенную бумагу в атмосфере аммиака. [c.336]

В изоэлектрическом фракционировании, или фокусировании, сокращенно ИФ) используется градиент концентрации ионов, который влияет на заряд разделяемых компонентов, например Н+ и комплексообразующих ионов. Самый обычный пример — ИФ амфотерных макромолекул, главным образом белков при градиентном изменении pH. Белки значительно различаются по своим изоэлектрическим точкам, т. е. по значениям pH, при которых они имеют нулевой заряд. При pH меньшем, чем изоэлек-трическая точка, белок приобретает положительный заряд, и поэтому движется в электрическом поле как катион. При наличии градиента pH, который увеличивается от анода к катоду, ион движется к точке, у которой он потеряет свой положительный заряд или станет полностью электрически нейтральным. Такой градиент pH можно создать с помощью системы буферных растворов. Однако описанный метод не нашел широкого применения. Свенсон [95] теоретически обосновал и подтвердил практически преимущества применения устойчивого естественного градиента pH. Градиент такого типа наблюдается при электролизе смеси амфотерных веществ. Стационарное состояние устанавливается в том случае, когда амфолиты располагаются в порядке увеличения изоэлектрической точки р1 от самого низкого значения (вблизи анода) до самого высокого (вблизи катода). Практическое использование этого метода возможно при подборе подходящей смеси амфолитов-носителей. Амфолиты долж- [c.318]

Чтобы получить слой геля размером 20X10X1 мм, смешивают 6 мл раствора акриламида, 1,6 мл каталитического раствора и 0,7 мл 40 %-ного раствора амфолита-носителя (LKB Produ ter-AB) и доводят объем смеси до 36 мл. Бин и Реш [c.172]

Одно из преимуществ тонкослойной изоэлектрической фокусировки — малый расход амфолитов-носителей. Это очень важное преимущество, так как поставляемый фирмами амфо-лит (амфолин) очень дорог. Он представляет собой синтетическую смесь низкомолекулярных полиаминокарбоновых кислот неизвестного состава. [c.173]

Ландблед и сотр. [396] синтезировали более щелочные амфолиты (с верхним пределом pH 11,1). В более поздних работах Ригетти и сотр. [397, 398] рассматривается синтез и фракционирование амфолитов-носителей. [c.174]

Концентрация амфолита-носителя имеет большое значение. Конерт и сотр. [389] исследовали некоторые факторы, влияющие на изоэлектрическую фокусировку. При содержании амфолитов порядка 1 % получить стабильный линейный градиент pH не удавалось и приходилось увеличивать концентрацию до 2 %. Эти авторы нашли также, что получить равномерный градиент pH можно, заменив гидроксид натрия и серную кислоту на аноде на 1 % -ную фосфорную кислоту, а на катоде — на 1 %-ный раствор этилендиамина. Применение более высоких концентраций амфолитов не улучшало разделение, а лишь уменьшало скорости перемещения белков. [c.174]

Существует несколько методик обнаружения полос белков, разделенных методом изоэлектрической фокусировки. Однако при применении некоторых детектирующих реактивов необходимо перед опрыскиванием пластинки удалить из геля амфолиты-носители. Для этой цели Боур [399] промывал гели 6— [c.178]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология