Поликлональные антитела, очистка

В разделе изложены методы иммунизации животных и гибридизации клеток для получения поликлональных и моноклональных антител, методы получения препаративных количеств антител и их очистки, способы введения ферментных меток в антитела и антигены для использования в иммуноферментном анализе, способы введения радио-изотопных меток в антитела для радиоиммунного анализа, методы изучения антигенных свойств ферментов [c.307]

Получение и очистка поликлональных антител [c.161]

Очистка антигена. Цитозольную фракцию из мозга свиньи (с. 379) пропускают через колонку с иммуносорбентом (1x2 см) в фосфатном буфере (pH 7,4) и колонку промывают тем же буфером. Элюцию проводят 2 М глициновым буфером (pH 2,8), фракции нейтрализуют 2 М трис-НС1 буфером, pH 8,6 Определяют концентрацию белка, цАМФ-связывающую активность (с. 331) она не должна быть ниже 12 нмоль/мг. Проверяют чистоту полученного препарата регуляторной субъединицы (м. м.=56 ООО Да) методом электрофореза (с. 119). Таким же способом, имея моноклональные или поликлональные антитела к соответствующим антигенам, можно получить гомогенные препараты этих антигенов. [c.325]

ПОЛУЧЕНИЕ И ОЧИСТКА ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ГЕТЕРОЛОГИЧНЫМ ФРАГМЕНТАМ ГИБРИДНЫХ БЕЛКОВ, СОДЕРЖАЩИХ -ГАЛАКТОЗИДАЗУ [c.138]

Для получения поликлональных антисывороток, используемых в повседневных иммунологических методах исследования, особенно в реакциях преципитации, применяют более крупных животных, в частности лабораторных кроликов. Кроликов можно содержать в клетках, они хорошо размножаются в неволе, выносливы и долго живут. Уход, иммунизация и взятие Крови у этих животных не представляют труда. Полученные от кроликов антисыворотки обладают хорошими преципитиру-ющими свойствами и стабильны при хранении, иммуноглобулиновая фракция легко поддается очистке. Кроме того, такие антисыворотки, обладая высокой авидностью/аффинностью пригодны для использования в чувствительных иммунологических тестах. В течение нескольких месяцев в период максимального ответа можно получить не менее 100 мл антисыворотки и еще 150 мл при аутопсии. Аутбредные кролики отвечают на иммуноген по-разному, поэтому следует использовать для иммунизации несколько животных, протитровать их сыворотки по отдельности, затем смешать отобранные пробы, если требуется максимальное разнообразие антител. Кролики достаточно хорошо отвечают на широкий спектр ммуногенов в сочетании с адъювантом Фрейнда образованием IgG. [c.41]

Проще всего использовать колонки с иммобилизованными поликлональными антителами для очистки антигена от незначительных примесей, если эти примеси не ассоциированы с его молекулами [8]. Можно использовать специфическую антисыворотку с высоким содержанием антител к примесям или вы- [c.164]

На практике колонки с достаточно аффинными МКА всегда. можно с пользой применить для очистки антигена, в то время как колонки с поликлональными антителами нередко для этого непригодны. На наш взгляд, основная причина широкого применения иммобилизованных МКА для аффинной очистки — это возможность их получения в препаративных количествах, иммунизируя продуцентов неочищенными антигенами. [c.165]

В настоящей главе мы, во-первых, опишем методы очистки кроличьих поликлональных антител к мышиным и крысиным [c.165]

Несмотря на сравнительную простоту аффинной очистки антител, обратная процедура, а именно очистка антигена на колонке с иммобилизованными антителами, была, как правило, неэффективной. Дело в том, что для получения специфической антисыворотки обычно требуется чистый антиген, а его легче очистить традиционными методами, чем при помощи колонки с иммобилизованными специфическими поликлональными иммуноглобулинами. Одна из причин неэффективности колоночной очистки в данном случае заключалась в том, что специфические антитела составляют весьма незначительную долю всех иммобилизованных иммуноглобулинов. [c.164]

Многие интерфероны были в последнее время успешно очищены. Наиболее эффективные этапы очистки включают хроматографию на голубой сефарозе и веществах, хелатирующих Си и Zn [21, 127], адсорбционную хроматографию на пористом стекле [116, 267, 279] и иммуноаффинную хроматографию с использованием как поликлональных, так и моноклональных антител [30, 170]. Процедуры очистки с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии и электрофореза в полиакриламидном геле с ДСН позволяют одновременно получать интерфероны разных классов [99]. [c.54]

Очистка поликлональных антител путем специфического связывания с нерастворимым антигеном всесторонне разрабатывалась как один из видов аффинной хроматографии [1] и вошла в широкую практику после открытия бромциановой активации, позволяющей присоединять содержащие аминогруппы лиганды к гранулированной полисахаридной матрице, в частности к агарозной [2, 3]. [c.164]

Колонки с иммобилизованными поликлональными антителами, выделенными из сыворотки продуцентов, иммунизированных частично очищенным антигеном, все же оказывались полезными в ряде случаев. С помощью таких колонок удалось увеличить степень очистки некоторых вирусных ферментов [4] и интерферона человека [5], они использовались для первичной очистки антигенов клеточной поверхности Thy-1 и HLA. Тимо-цитарный антиген Thy-1 был аффинно очищен на колонке с антителами к полуочищенному мозговому Thy-1 [6], а нативная димерная форма HLA была выделена с помощью иммобилизованных антител к 2-2-микроглобулину, который представляет собой легкую цепь этого димера и может быть в свою очередь получен из мочи при патологии почек [7]. [c.164]

Поскольку получение антител — это сложный процесс, им-муноадсорбционные колонки до сих пор еще не нашли широкого применения. Однако новая технология получения моноклональных антител может революционизировать этот способ очистки ферментов. Ниже мы сначала расскажем о методах и проблемах, связанных с применением обычных поликлональных антител, а затем кратко наметим пути преодоления большинства возникающих при этом трудностей. [c.173]

Большое разнообразие макромолекул, изучаемых с помощью антител, включает не только естественные продукты животных н растений, но, и продукты микробного происхождения, и синтетические вещества. Приготовление поликлональной антисыворотки к определенным молекулам может включать предварительную очистку, если нельзя получить очищенный коммерческий препарат. Для компонентов клеточной поверхности современный подход — это получение моноклональных антител требуемой специфичности при этом решается проблема очистки иммуногена (см. гл. 3). С другой стороны, с помощью уже существующих антител можно очистить компоненты клеточной поверхности, а также проводить обогащение клеток, экспрессирующих антиген-мишень. Эти подходы обсуждены в гл. 5. Метод экстракции имеет большое значение в тех случаях, когда необходимо получить полиспецифическую антисыворотку к смеси иммуногенов, например экстрагированных клеточных мембран, гомогенатов тканей, разрушенных ультразвуком бактерий, вирусов и паразитов. Невозможно в этой главе привести детальное руководство по экстракции и очистке огромного разнообразия иммуногенов. Существует специальная литература, посвященная методам получения углеводных, бактериальных, вирусных, грибковых и паразитарных антигенов [21]. Очистка с помощью аффинной хроматографии описана в гл. 5, а приготовление иммуноглобулинов [c.50]

Выбор того или иного метода выделения антигенов клеточной поверхности определяется несколькими соображениями. Одно из них — это доступность клеток или тканей в качестве источника антигена. Культуры клеточных линий представляют собой постоянный и очень однородный источник антигенов. Мо лекулы, с которыми специфически реагируют поликлональные и моноклональные антитела, как правило, относятся к интегральным мембранным гликопротендам, поэтому первым этапом очистки этих молекул должно быть выделение мембран. Уже этот этап дает примерно 50-кратиую очистку поверхностных антигенов, так как мембраны содержат около 1% всех белков клеткн. [c.54]

Источником гомогенных антител чаще всего служат миеломы (Eisen et al, 1968). При аналитическом изоэлектрофокусировании (ИЭФ) такие антитела обычно дают от трех до пяти полос (Askonas et al., 1970). Имеются данные, что эта микрогетерогенность — следствие тех небольших модификаций, которые антитела претерпевают в момент секреции или (и) после выхода из антителообразующих клеток (Awdeh et al., 1970). Поэтому даже при работе с миеломными белками необходима дополнительная очистка антител. В этой главе будет рассмотрено применение препаративного ИЭФ для выделения кроличьего моноклонального IgG из материала поликлонального происхождения. [c.135]

Для реализации потенциальных преимуществ системы анализа с использованием меченых антител необходимо работать в условиях избытка связывающих реагентов. В связи с этим поликлональные антисыворотки, доступные в ограниченном количестве, представляют собой далеко не идеальные компоненты иммунометрической системы анализа. Для выделения из поликлональной сыворотки антител, строго специфичных к определенному участку структуры, как правило, необходим достаточна громоздкий процесс очистки, причем очистка может влиять на активность антител и приводить к значительным потерям материала. [c.388]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология