Реакции с использованием меченых антител

Реакции с использованием меченых антител или антигенов. Реакция иммунофлюоресценции — РИФ (метод Кунса) основана на том, что антигены тканей или микроорганизмы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа (прямой метод). Бактерии в мазке, обработанные такой специфической сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета. Различают фи основные разновидности метода прямой, непрямой, непрямой с комплементом. [c.180]

РЕАКЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕЧЕНЫХ АНТИТЕЛ [c.105]

Яне 22. Серологические реакции с использованием меченых антител Аг — антиген — иммунная сыворотка [c.106]

СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МЕЧЕНЫХ АНТИТЕЛ [c.109]

Различают реакции агглютинации, преципитации, нейтрализации, реакции с участием комплемента, с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологический, иммуноферментный, иммунофлюоресцентный). Перечисленные реакции отличаются по регистрируемому эффекту и технике постановки, однако все они основаны на реакции взаимодействия антигена с антителом и применяются для выявления как антител, так и антигенов. [c.176]

Принцип использования флуоресцирующих антител был приспособлен и для электронной микроскопии антитела или гаптены соединяются с электроноплотными веществами (например, с железосодержащим белком ферритином) или такими, которые могут быть сделаны электроноплотными уже после реакции антиген — антитело (например, с антителом связывается пероксидаза из хрена, которой после связывания дают возможность реагировать с диаминобензидином). На практике используется множество комбинаций, включающих антисыворотки с различными специфичностями, фрагменты антител, гаптены, а также такие маркеры для визуализации, как небольшие вирусы и т. п. Эти методы, применимые к целым бактериям, позволяют локализовать поверхностные антигены точнее, чем это делают с помощью оптического микроскопа. Преимущества электронной микроскопии становятся еще более очевидными, когда меченые антитела применяют еще до фиксации, заливки и приготовления срезов, так что метка видна в тонких срезах. В некоторых случаях аналогичным образом метят не антитела, а другие вещества с известной специфичностью чаще всего применяются лектины растений, такие, как конканавалин А, которые специфично связываются с сахарными остатками [88]. [c.125]

Серологические реакции с использованием меченых антител прочно вошли в практику экспресс-диагностики вирусных и бактериальных инфекций, широко используются в идентификации и дифференциации антигенов микробного, животного и растительного происхождения. [c.106]

В этих методах применяются мечение антигенов или антител и иммобилизация на твердой подложке одного из реагентов [34] под таким названием разработано много вариантов [113]. Иммобилизация выполняется на дне пробирок или чаще в микрокюветах, вмонтированных в пластиковые планшеты. Для мечения часто используют пероксидазы, щелочные фосфатазы, глюкозооксидазу. Возможно использование реакций конкуренции между мечеными и немечеными реагентами пример такого рода схематически представлен на рисунке 4.9. Можно описать еще один вариант метода, не основанный на реакциях конкуренции [c.106]

Иммуноферментный анализ. Метод широко внедрен в лабораторную практику в последнее время. В основе метода— использование антител, меченных ферментами (чаще всего пероксидазой). Конъюгацию осуществляют глутаровым альдегидом или другим бифункциональным реагентом. Реакцию проводят в условиях, исключающих инактивацию фермента. Техника постановки реакции состоит в следующем. Антиген адсорбируют на поверхности лунок в пластинах из полистирола. Если антитела, меченные ферментом, направлены к адсорбированному антигену, они окажутся фиксированными в лунках. Затем в лунки вносят раствор субстрата (если к антителам присоединена пероксидаза, то это перекись водорода и индикатор — диаминобензидин). В результате ферментативного превращения субстрата появится цветной продукт. Степень окраски пропорциональна количеству сорбированных антител с ферментом. [c.263]

Особое распространение получили методы, основанные на использовании антигенов и антител, меченных ферментами, — так называемый иммунофермеитный анализ. Они используются для изучения широкого круга соединений — антител, пептидных и стероидных гормонов, вирусных и бактериальных антигенов, различных белков и ферментов. Существуют гетерогенные (твердофазные) и гомогенные методы иммуноферментного анализа, принципиально различающиеся способом разделения компонентов иммунохимической реакции. Твердофазные методы основаны на применении антител или антигенов, иммобилизованных на нерастворимых носителях. [c.306]

Специфические белки при использовании специфических реакций антиген — антитело выявляются под микроскопом с помощью реакций с антителами, меченными флуоресцеином. [c.65]

Введение моноклональных антител в систему анализа, основанную на применении меченых антител, позволяет улучшить большую часть характеризующих ее параметров. Химическая гомогенность моноклональных антител обеспечивает надежность и воспроизводимость анализа. Кроме того, использование для иммунометрического анализа моноклональных антител, конъюгированных с ферментом, позволило приблизиться к реализации режима кинетики первого порядка (Вагапу, 1980). Порядок химической реакции соответствует показателю степени у величины концентрации реагента в кинетическом уравнении. Реакциям, скорость которых постоянна и не зависит от концентрации, соответствует нулевой порядок. Если концентрация одного из реагентов лимитирована, то скорость реакции оказывается пропорциональна его концентрации. Если лимитирующими оказываются два или три реагента, то скорость реакции зависит от концентрации каждого из реагентов и кинетика реакции приобретает сложный характер. [c.389]

Существуют два метода иммунохимического окрашивания. В первом используют антитела, меченные радиоактивным иодом, а затем проводят авторадиографию. Второй метод основан на принципе ELISA и предусматривает использование антител к иммуноглобулинам, конъюгированных с ферментом, и реакцию локального окрашивания, когда субстрат. превращается в нерастворимый окрашенный продукт в участках расположения комплексов антиген — антитело [10]. При использовании любого метода возникают проблемы неспецифического связывания, которые в обоих случаях решаются одинаково. Благодаря простоте и возможности длительного хранения реагентов иммуноферментный метод применяют чаще, за исключением тех случаев, когда требуется высокая чувствительность. Ниже приведено описание иммуноферментного метода, а в технических замечаниях описана процедура авторадиографии. Методы приготовления антител к иммуноглобулинам описаны [c.232]

В анализируемом растворе меченый и немеченый h G конкурируют между собой за связывание с антителом на мембране. После этого мембрану промывают, чтобы отделить связанный h G от свободного, и выдерживают в растворе пероксида водорода. В присутствии каталазы пероксид водорода разлагается с образованием кислорода и воды. Контроль реакции ведут по скорости увеличения давления кислорода. При построении градуировочной кривой предполагается, что сенсор регистрирует активность h G от 0,02 до 100 международных единиц/1 мл. К сожалению, при использовании одного антитела аналитические свойства сенсора постепенно ухудшаются из-за изменчивости гормонов. Существуют, однако, хорошие моноклональные антитела к а- и р-субьединицам h G, и анализатор сандвич-типа ELISA (в котором используется немеченый h G, а метку содержит второе антитело) мог бы стать основой для создания усовершенствованного биосенсора h G. [c.59]

Разработка метода определения опиатов на основе латексной агглютинации. На основе полученных реагентов - антител к опиатам и конъюгата морфина меченого латексом, был разработан метод для выявления опиатов в биологических жидкостях организма с использованием латексной агглютинации. Для этого непосредственно перед работой разводили латексный конъюгат до 1% концентрации буферным раствором. Специфичные антитела против опиатов разводили в плашке, используя серию двойных последовательных разведений. Для проведения опыта в микрокамеры с коническими лунками вносили по 10 мкл сыворотки каждого разведения и быстро добавляли равную аликвоту раствора латекса, модифицированного морфином или конъюгатом морфин-овальбумин. В качестве контроля использовш1и лунку, в которую не добавляли антитела. Интенсивность реакции агглютинации оценивали через 1 час по 4-крестовой схеме [2]. Из полученных результатов выбра1ш условия для проведения реакции ингибирования. Для этого использовали концентрацию антигена на латексе 100 мкг/мл и 50 мкг/мл, а разведения сыворотки соответствовали 1 16, 1 32 и 1 64, Морфин вносили в лунки после серии пятикратных разведений в интервале концентраций от 500 мкг/мл до 200 нг/мл, В каждую лунку вносили 7 мкл антиопиатной сыворотки, 7 мю1 раствора морфина соответствующей концентрации и 7 мкл раствора латекса. Контрольные [c.202]

Работа с антителами зачастую требует от исследователя самостоятельного получения реагентов, в связи с чем в первую очередь возникает задача получения иммуногена. В случае растворимых простых иммуногенов для достижения хороших результатов молекулы должны быть как можно лучше очищены. Поэтому первый рассматриваемый метод — это оценка чистоты антигенного препарата. После сбора антисыворотки необходимо оценить ее качество. В зависимости от характера тест-системы, используемой на заключительном этапе, сыворотку необходимо проверить на специфичность, титр и параметры связывания. Это требует знания процедур контроля качества, в некоторых случаях включающих в себя определение изотопического спектра антител. На заключительном этапе важен правильный выбор теста (табл. 1.2)—.например, выбор между иммунофлуоресцентным и иммунопероксидазным методами в случае тканевых и клеточных антигенов либо между агглютинацией, ELISA, РИА и реакциями преципитации в случае растворимых антигенов. При использовании некоторых тест-систем может потребоваться очистка антител для последующего мечения либо получение и мечение антиглобулинового реагента. К оценке преимуществ и недостатков тест-систем следует подходить осторожно. [c.30]

Для практических измерений по крайней мере один из трех компонентов, составляющих равновесную смесь (свободные эпитопы, свободные паратопы, комплексы эпитоп — паратоп), должен быть отделен от двух других. Если имеется существенная разница в размерах, разделение не составляет труда. Так, гаптены будут диффундировать сквозь мембраны, задерживающие антитела, создавая с наружной стороны мембраны концентрацию, равную [Е—х]К В случае корпускулярных антигенов оставшиеся свободными антитела [Р—х] могут быть отделены либо в виде надосадочной жидкости после центрифугирования, либо в виде фильтрата при пропускании равновесной смеси через фильтр, задерживающий антиген, а значит, и комплексы антиген — антитело. Когда два реагента имеют сходные размеры, как, например, в реакциях идиотоп — антиидиотоп, простое механическое разделение невозможно. В этих случаях используются другие приемы (в частности, мечение одного из реагентов и использование преципитирующего агента к одному из них, регистрация образования комплексов по каким-либо физическим, обычно оптическим, изменениям в системе или привязывание одного из реагентов к нерастворимой основе или к частицам носителям, что позволяет далее воспользоваться механическим разделением). [c.15]

Более изящное использование щелочной фосфатазы как метки продемонстрировано Дойлом и др. [3, 4]. В качестве модельного антигена авторы использовали оросому-коид из сыворотки крови человека, представляющий собой небольшой гликопротеин (молекулярный вес 41 ООО), который имеет отношение к различным злокачественным образованиям [4] и, по-видимому, связан с карциноэмбриональным антигеном. В этот белок вводили метку щелочной фосфатазы. В системе проходила конкурентная реакция между антителом к белку оросомукоида, иммобилизованным на поверхности кюветы, и белком, меченным ферментом. Через соответствующий промежуток времени кювету промывали и добавляли раствор субстрата-фенилфосфата, который под действием [c.59]

К счастью, потенциометрические методы иммуноферментного анализа не обязательно являются гетерогенными по своей сути. Гомогенные методы удобнее, чем гетерогенные, так как включают меньшее число операций. Фононг и Рехнитц [6] описали метод гомогенного потенциометрического иммуноферментного анализа для человеческого иммуноглобулина О с использованием СО2-электрода. В этом методе получают конъюгат IgG, меченный ферментом, и затем ингибируют активность последнего, связывая конъюгат с антителами к IgG. Используемая ферментная метка, хлоропероксидаза, несколько необычна. Это гем-содержащий фермент, который катализирует ряд реакций галогенирования органических молекул в присутствии пероксида водорода и соответствующего галогенида, например бромирования (3-кетоадипиновой кислоты. Этот процесс сопровождается образованием СО2, что и используют в данном аналитическом методе [c.62]

Представляет интерес сенсор [40], основанный на принципе конкуренции глюкозы и меченного флуоресцеином полидекстрана за связывание с белком конканавалином А, иммобилизованным на внутренней поверхности полой диализной трубки (гл. 32). Конструкция этого аффинного сенсора включает оптическое волокно, вставленное в диализную трубку, что позволяет непосредственно определять несвязанный меченый декстран. Преимуществом данного сенсора по сравнению с глюкозооксидазными сенсорами является то, что его сигнал определяется конкурентным равновесием между глюкозой и формирующим сигнал лигандом. Поэтому кинетика ферментативных реакций и загрязнение электрода не влияет на величину сигнала. Оптимальной избирательности и чувствительности такого сенсора можно достичь подбором соответствующих связывающего белка и конкурентного лиганда например, можно было бы использовать специфические антитела. При использовании сенсора in vivo его недостатками являются все еще ограниченная стабильность и относительно большое время отклика. [c.326]

Определение антител класса IgE in vitro. Лабораторная диагностика заболеваний, в основе которых лежит ГНТ, основана на определении аллергенспецифических IgE анти-IgE. При использовании радиоактивной метки (см. подразд. 1.4.5) метод носит название радиоаллергосорбентного теста (РАСТ), но чаще в качестве метки используют фермент или флюоресцирующее вещество (ФАСТ). Время анализа — 6 — 7 часов. Принцип метода фиксированный на твердой основе известный аллерген инкубируют с сывороткой крови больного находящиеся в сыворотке специфические IgE анти-IgE связываются с аллергеном и, таким образом, остаются фиксированными на основе и могут вступать в специфическое взаимодействие с добавляемыми мечеными анти-IgE. Результаты реакции обычно выражают в единицах РАСТ или МЕ (при использовании соответствующего стандартного препарата). Результаты аллергосорбентного исследования имеют высокую степень корреляции с результатами кожного тестирования. [c.88]

Смотреть страницы где упоминается термин Реакции с использованием меченых антител: [c.228] [c.358] [c.216] [c.252] [c.175] [c.163] [c.395] [c.413] [c.532] [c.302] [c.258] [c.88] [c.230] [c.87] [c.127] [c.13] [c.75] [c.118] [c.120] [c.270] [c.440]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология