Очистка плазмид

Рис. 87. Очистка ДНК плазмиды pBR 322 в системе ХОФ-5 (по данным фирмы BRL )

ДНК-иммунизация позволяет не только избежать очистки белковых антигенов, но и индуцировать иммунный ответ, направленный именно на кодируемый плазмидой белок, а не на саму плазмиду. Поэтому один и тот же вектор можно использовать для доставки разных белков или для многократного введения одного и того же гена. [c.233]

С помощью этого метода можно получить до 1 мг высоко-очищенных плазмид. Малые РНК (такие как тРН К), которые являются единственными примесями в таких препаратах, устраняются на дальнейших этапах очистки (этап 12). Однако все ферментативные реакции с этими препаратами (гидролиз рестриктазами, ник-трансляция, реакция с ферментом Кленова, лигирование и т. д.) протекают столь же эффективно, как и в случае плазмид, очищенных с помощью градиента хлористого цезия. Далее фрагменты рестрикции ДНК можно очищать в низкоплавкой агарозе или полиакриламидных гелях без каких-либо сложностей. [c.78]

Для некоторых систем созданы плазмиды, известные как секретирующие векторы. Такие плазмиды производят клонирующий ген, который секретируется в культуральную среду. Это обеспечивает очевидные преимущества при выделении и очистке фермента. [c.96]

Сефакрилы используют для очистки плазмид, рибосом п даже целых вирусов, для фракционирования рестрпктазных фрагментов ДНК и др. Соответствующие пртгеры приведены ниже. [c.119]

Плазмиды. Как уже отмечалось, (см. гл. 2), плазмиды представляют собой внехромосомные генетические элементы, которые встречаются во многих видах бактерий. Они существуют обычно в виде ковалентно замкнутых кольцевых суперспиральных молекул ДНК, что является физической особенностью, которая лежит в основе ряда методов очистки плазмид. В качестве векторов используются обычно небольшие плазмиды размером до 15— 20 т. п. о., чаще всего от 2 до 10 т. п. о. [c.143]

Рассмотрим теперь совсем недавний пример разделения ДНК и РНК. Здесь решалась более тонкая задача разделения НК, соизмеримых по своим размерам, а именно очистки ДНК плазмиды pBR 322 от примеси РНК. Присутствие РНК в препаратах плазмидной ДНК мешает протеканию некоторых ферментативных реакций и затемняет результаты введения концевой радиоактивной метки. Оказалось, что даже интенсивная обработка РНКазой (50 мкг/мл, 37°, 1 ч) не расщепляет РНК полностью, а лишь дробит ее на фрагменты, не обнаруживаемые электрофорезом в 1%-ном геле агарозы (они уходят вперед), но переосаждающиеся этанолом вместе с плаз-мидной ДНК. Кроме того, обработка РНКазой вообще нежелательна. Несмотря на предварительный прогрев, в ней остается небольшая [c.143]

Еще более крупнопористую жесткую матрицу — сефакрил S-1000 — недавно было предложено использовать для быстрой препаративной очистки ДНК плазмид от примеси ДНК бактерии-хозяина. Последняя при гель-фильтрации на указанной матрице выходит на переднем фронте высокомолекулярного пика ДНК, и ее можно отбросить. РНК в этом случае предварительно переваривали РНКазой [Bywatpr et al., 1983]. [c.144]

Рис. 148. Последовательность операций отбора и очистки комплементарных к определенному гену участков ДНК пли РНК гибридизацией с меркурпрованньшп фрагментами плазмид со встроенным геном, по которому ведется отбор (см. текст) [Longa re, Ma h, 1978

Новый подход, позволяющий индуцировать у организма иммунный ответ без введения антигена, основан на включении в клетки животно-го-мишени гена, кодирующего белок-антиген. В первых экспериментах такого рода Е. соН-плазмиду, содержащую клонированный ген белка-антигена, транскрипция которого находилась под контролем промотора вируса животных, конъюгировали с микрочастицами золота и бомбардировали ими клетки уха мыши. Впоследствии выяснилось, что клонированную кДНК можно вводить в клетки и с помощью внутримышечной инъекции раствора с большим количеством плазмиды, несущей соответствующую ДНК. Для этого необходимо в 10 -10" раз больше ДНК, чем при бомбардировке микрочастицами. В одном из экспериментов более чем в 75% случаев ген включался в клетки мыши, и синтезированный белок-антиген индуцировал синтез антител. Этот подход позволяет избежать очистки антигена, что требует много времени и средств, или использования для соз- [c.233]

Оптимальный метод выделения высокомолекулярной ДНК из донорного штамма или трансфецирующей ДНК бактериального вируса часто зависит от особенностей соответствующих бактерий ил1/ вирусов. Общие принципы и методы разрушения клеток грамотрицательных и грамположительных бактерий с целью выделения ДНК приведены в гл. 22. Чаще других для выделения и очистки высокомолекулярной ДНК из микроорганизмов применяется метод, описанный Мармуром [29]. Он подробно изложен в разд. 22.2.1. Однако в большинстве случаев использование высокоочищенных препаратов ДНК, не содержащих РНК и другие примеси, необязательно поэтому можно обойтись без обработки рибонуклеазой. Специальные методы выделения ДНК плазмид описаны в гл. 15. [c.67]

Этим методом от основной массы хромосомной ДНК и клеточных обломков отделяется около 95% плазмид. Обогащенную плазмидами надосадочную фракцию (3,2 мл) подвергают дальнейшей очистке и концентри-рованию центрифугированием в градиенте плотности хлористого ц.езия в присутствии бромистого этидия (це-зий-этидиевый градиент разд. 15.3.3). [c.131]

Этот этап нужен, чтобы избавиться от ложных клонов, возникших в результате трансформации плазмидой-зондом или ведущих свое происхождение от клеток, переживших обработку хлороформом. На этой стадии происходит также очистка клонов и элиминация смешанных колоний, возникших при заражении клетки более чем одной космидой. В качестве альтернативы может быть использован метод упаковки in vivo с использованием суперинфекции (табл. 3.2). [c.93]

Мы пришли к выводу, что для самых разнообразных иммунологических исследований необходимо получать максимально возможное количество нативного белка. Это легче всего достигается с помощью классических хроматографических методов, детально описанных в разд. 5.3.3.3, которые наиболее успешно работают при использовании экспрессирующих систем на основе плазмид pUR. Другие методы применяют, когда возникают сложности с выходом, растворимостью или стабильностью гибридного белка. Например, к выделению гибридных белков методом ДСН-электрофореза в ПААГ следует прибегать в последнюю очередь, а не использовать его сразу из-за его простоты, поскольку денатурированные ДСН белки меняют свои иммуно-генные свойства и с их помощью не всегда удается получить антисыворотку к нативному белку. Если антисыворотка в основном будет использоваться в вестерн-блот-анализе, то в этом случае денатурированные под действием ДСН иммуногены могут оказаться пригодными. Иммуноаффинные методы очистки можно эффективно использовать в ограниченном масштабе, поскольку, к сожалению, элюируемые белки, как правило, необратимо денатурированы реагентами, используемыми для разрушения комплексов антиген—антитело. С помощью хроматографии на АФТГ-агарозе можно получить чистый растворимый белок, но метод не очень эффективен и дает очень низкий выход белков, содержащихся в клетке в небольшом количестве или обладающих низкой стабильностью. Выбор того или иного метода поможет сделать анализ результатов прикидочного выделения и очистки. [c.155]

На самом деле, реальные векторы должны обладать еще целым рядом свойств в зависимости от целей их применения. Так, очень важно, чтобы вектор позволял осуществлять вставку чужеродной ДНК различной молекулярной массы и чтобы свойства вектора давали возможность различать клоны бактерий, несущих исходные векторные и рекомбинантные молекулы. Удобно работать с небольшими по размеру векторами, которые к тому же дают большое число копий на клетку, что облегчает выделение и очистку векторной и рекомбинантной ДНК. Векторная молекула должна иметь как можно больше единичных последовательностей, узнаваемых различными рестриктазами, что может обеспечиваться введением полилинкеров. Лучше всего разработана система вектор — хозяин для бактерий Е. соИ. В этом случае используется четыре типа векторов 1) плазмиды 2) бактериофаг Я. 3) производные бактериофага Я, (космиды и фазмиды) [c.143]

Для субклонирования используется векторная плазмида рВК322. Этот вектор является Атр Те1 Выделяют ДНК этой плазмиды и проводят ее очистку равновесным центрифугированием в градиенте плотности хлористого цезия с бромистым эти- [c.52]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология