ДНК рестрикция, типы фрагментов

Известно три основных типа ферментов рестрикции. Рестрицирующие эндонуклеазы (рестриктазы) первого типа узнают определенную последовательность нуклеотидов и разрезают двухцепочечную молекулу ДНК неподалеку от этой последовательности, но само место разреза не строго специфично. Эндонуклеазы рестрикции второго типа узнают определенную последовательность и разрезают двойную спираль в определенной фиксированной точке внутри этой последовательности. Эндонуклеазы рестрикции третьего типа узнают нужную последовательность и разрезают двойную спираль, отступив определенное число нуклеотидных пар от ее конца. Мы в основном сосредоточимся на обсуждении свойств эндонуклеаз второго типа, поскольку именно они позволяют, во-первых, получать препараты ДНК, содержащие фрагменты с одинаковыми последовательностями нуклеотидов и, во-вторых, конструировать химерные молекулы ДНК, состоящие из фрагментов, взятых из разных геномов. [c.267]

Практически все виды бактерий синтезируют но одному или по несколько типов специфических к определенной нуклеотидной последовательности эндонуклеаз, которые делают разрезы в двухцепочечной ДНК. Эти эндонуклеазы называются рестрицирующими ферментами (или рестриктаза-ми), поскольку их основная функция состоит, но-видимому, в ограничении присутствия инородной ДНК в бактериальной клетке (рестрикция буквально означает ограничение). ДНК клеток, синтезирующих ферменты рестрикции, защищена от их действия, потому что клетки синтезируют также модифицирующие ферменты, видоизменяющие структуру сайтов ДНК, узнаваемых ферментом рестрикции. Если клетка с действующей системой рестрикции и модификации инфицируется фагом с заранее не модифицированной ДНК, то вероятность того, что ДНК такого фага инициирует инфекцию, на несколько порядков меньше, чем для фага с модифицированной ДНК. Немодифицированная ДНК фрагментируется, число фрагментов зависит от числа сайтов узнавания в соответствующей молекуле ДНК, а затем фрагменты расщепляются экзонуклеазами. Изредка ферменты клетки-хозяина модифицируют фаговую ДНК до того как ее атакуют рестриктазы. В этом случае фаговая инфекция приводит к лизису клетки. Все потомки такого фага содержат тоже модифицированную ДНК и способны с высокой эффективностью заражать другие бактериальные клетки (с такой же системой рестрикции и модификации). Изучение закономерностей фаговой инфекции и привело к открытию систем рестрикции и модификации ДНК и разработке методов получения чистых препаратов соответствующих ферментов. [c.266]

Типы полиморфизма ДНК. Наиболее распространенный тип полиморфизма ДНК-рестрикционный полиморфизм. Если в сайте узнавания для какой-то рестриктазы происходит точечная мутация, фермент не распознает свой сайт и не разрезает ДНК (рис. 2.84). Имея под рукой специфические ДНК-зонды и рестриктазы, можно анализировать ДНК. Рестрикционные фрагменты ДНК (рестрикты) различаются по длине (полиморфизм по длине рестрикционных фрагментов). Они идентифицируются по различной подвижности после гибридизации по Саузерну (рис. 6.5). В настоящее время метод гибридизации по Саузерну включает радиоактивное мечение. Вероятно, в будущем появится возможность нерадиоактивного мечения фрагментов ДНК. Точечные мутации, заменяющие один нуклеотид на другой в некодирующем районе ДНК, встречаются очень часто. Немногие систематические исследования изменчивости ДНК проводились путем анализа с использованием большого количества рестриктаз в небольшой выборке особей (10 12). Результаты, полученные для хорошо изученных к настоящему времени областей генома (гемоглобина, альбумина и сегментов ДНК с неизвестной функцией из разных хромосом) [1143 1742 1959], свидетельствуют о том, что уровень нуклеотидной изменчивости приблизительно на порядок выше, чем наблюдаемый по структурным генам, кодирующим белки. Это означает, что разница между случайно выбранными хромосомами составляет в среднем 75оо" 7г5о нуклеотидов (гетерозиготность = = 0,001 — 0,004). Особенно подходят для выявления вариантов ДНК ферменты Мер и Тая1, узнающие метилированный динуклеотид СрО. Большинство вариантов по длине рестрикционных фрагментов диморфны, т. е. имеют только два аллеля -присутствие ( + ) или отсутствие ( —) сайта рестрикции. Частота полиморфного ва- [c.288]

Рестриктазы II типа делятся на несколько классов в зависимости от размера сайта рестрикции и длины получаемых фрагментов ДНК [c.26]

Сопоставление карты рестрикции с генетической картой можно осуществить, действуя рестриктазами на ДНК, выделенную из различных мутантов фага X с известными делециями и перестройками в геноме. Сравнивая фрагменты ДНК фагов дикого типа и мутантных, можно определять участки генетической карты фага X, в которой локализованы соответствующие фрагменты. [c.272]

Рестриктазы II типа очень широко испачьзуются в методах генной инженерии для физического картирования ДНК и для выделения участков ДНК в составе того или иного рестрикционного фрагмента. Поэтому в течение ряда лет велся широкий поиск рестриктаз II типа с разной специфичностью (разными сайтами рестрикции). В результате сейчас известно более 350 рестриктаз разных бакте- [c.130]

Полиморфизм длины фрагментов рестрикции. Если имеется подходящий ДНК-зонд, то можно обнаружить прямым методом некоторые генетические болезни, возникающие вследствие мутаций (гемофилия, мыщечная дистрофия и др.). Ответственный за болезнь, но неидентифицированный ген может быть обнаружен, если он находится вблизи последовательности ДНК, поддающейся определению. Во всем человеческом геноме примерно одно из 150 оснований является полиморфным, т. е. варьируется у разных индивидуумов. Каждое щестое из этих случайных изменений или порождает, или разрушает участок рестрикции. В результате этого потенциальные участки рестрикции присутствуют вдоль молекулы ДНК с интервалом примерно в 1000 пар оснований. Их наличие или отсутствие у разных людей приводит к тому, что ДНК в процессе рестрикции разрезается на фрагменты разной длины (полиморфизм длины рестрикционных фрагментов). Если при обследовании членов семьи обнаруживается взаимосвязь между полиморфизмом длины рестрикционных фрагментов и наследственным заболеванием, делается заключение, что данный участок рестрикции расположен вблизи от гена, ответственного за патологию. В таком случае присутствие данного типа полиморфизма можно использовать для предсказания наличия мутантного гена у другого члена семьи или в ткани плода. Однако использование этой техники для пренатальной диагностики требует предварительного обследования семьи. [c.528]

Одна из наиболее часто возникающих проблем при анализе биологических текстов - поиск гомологий. И это понятно, поскольку схожесть текстов позволяет делать выводы об их эволюционной и/или функциональной близости. Здесь можно привести пример обнаруженной гомологии между определенными типами онкогенов и клеточными генами (НаЬагго et а1., 1984), что привело к возникновению нового направления исследований. Гомологии между последовательностями часто используют для реконструкции эволюционных деревьев. Такие важные аспекты анализа биологических текстов, как поиск повторов, палиндромов, симметричных участков, сайтов рестрикции, также связаны с проблемой поиска гомологий. Анализ гомологий необходим также при подготовке и проведении целого ряда экспериментальных работ, в частности при синтезе олигонуклеотидных зондов для поиска клонов в клонотеке, стыковке фрагментов нуклеотидных последовательностей при секвенировании протяженных участков ДНК или целых геномов и др. [c.11]

Очень полезно, а иногда и просто необходимо иметь рестрикционную карту такой клонированной вставки ДНК. Расположение сайтов рестрикции, особенно тех, что встречаются лишь 1—2 раза во всей плазмиде, можно определить при помощи стандартных методик рестрикционного картирования [24]. Для обоих типов одноцепочечных зондов необходимо иметь единичный сайт рестрикции в участке тестируемой ДНК, дистальном по отношению к сайту связывания с РНК-полимеразой в случае РНК-зондов (см. разд. 5.1) или с олигонуклеотидами в случае ДНК-зондов (см. разд. 6.3 и рис. 10). После реассоциации одноцепочечного меченого ДНК-зонда с тестируемой ДНК может возникнуть необходимость расщепить гибридную последовательность ДНК на 2—3 фрагмента с оптимальной для ДГГЭ длиной. В этом случае надо использовать сайты рестрикции, имеющиеся в тестируемом фрагменте. [c.141]

Последовательности нуклеотидов липких концов, образующихся под действием рестриктаз типа IIS, являются уникальными для каждого такого сайта рестрикции. Вследствие этого рестрикционные фрагменты ДНК, образовавшиеся под действием данной рестриктазы, в смеси соединяются друг с другом лишь в строго определенной исходной последовательности, которая задается уникальными последовательностями нуклеотидов в липких концах рестрикционных фрагментов ДНК. Например, при расщеплении рестриктазой типа IIS репликативной формы ДНК фага фХ174 образуется 14 фрагментов, которые in vitro объединяются в правильную последовательность с образованием инфекционной фХ 174-ДНК. [c.54]

Рестрикционные эндонуклеазы П-го типа являются гидрола-зами, специфически взаимодействующими с определенными короткими нуклеотидными последовательностями двухцепочечной ДНК и расщепляющими фосфодиэфирную связь в определенном месте относительно участка узнавания. Несмотря на то, что в настоящее время известно более 1000 рестриктаз, и более ста среди них широко используются в качестве аналитических реагентов, кинетика и механизм реакций катализируемых этими ферментами изучены недостаточно. С чем это связано Во-первых, в большинстве экспериментов обычно используется избыток эндонуклеазы рестрикции, чтобы обеспечить полное расщепление ДНК, поэтому не требуется знания определенных кинетических параметров фермента. Во-вторых, для изучения кинетики реакций ДНК с эндонуклеазами рестрикции, используются довольно сложные и относительно длительные количественные методы регистрации каталитической активности рестриктаз, например, разделение рестрикционных фралментов ДНК электрофорезом в агарозном или полиакриламидном геле с последующим определением относительного количества продуктов УФ-сканированием геля, окрашенного бромистым этидием (или фотонегатива этого геля) или подсчетом радиоактивности фрагментов при использовании меченной ДНК (разд. 1, часть II). [c.68]

Существуют разные способы внесения мутаций В клонированные фрагменты или небольщие геномы, НО мы рассмотрим лищь немногие из них. Во всех случаях успех зависит от двух условий. Во-первых, должна быть хорощо известна структура ИСХОДНОЙ ДНК. Как минимум, необходимо знать подробную карту сайтов рестрикции, но еще лучще, если известна вся последовательность изучаемого фрагмента. Во-вторых, поскольку все методы дают некую смесь продуктов, нужный элемент следует очистить с помощью клонирования, амплифицировать и охарактеризовать. Нри некоторых типах мутагенеза мутации образуются в случайных местах, при других—в определенных сайтах о последних говорят как о сайт-специфических (или сайт-направленных) мутациях. [c.343]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология