Рестриктирующие Eo RII

Бактерии часто переваривают и разрушают ДНК вторгшихся в них вирусов или ДНК, попавшую в клетку при спаривании с бактерией несовместимого штамма. В результате исследований этого интересного явления, получившего название рестрикция, было обнаружено, что ДНК вирусов, способных к репликации лишь в определенных клетках-хозяевах, в специфических местах каким-то образом маркирована. Причем во многих случаях метками являются метильные группы. Оказалось, что соответствующим образом метилированная ДНК не расщепляется бактерией, тогда как неметилированная ДНК расщепляется высокоспецифичной эндонуклеазой именно в тех местах, в которых обычно происходит метилирование. У каждого вида бактерий (а часто даже и у отдельных штаммов в пределах данного вида) имеются свои собственные рестриктирующие ферменты. Рестриктирующие ферменты обладают очень высокой степенью специфичности и часто разрезают ДНК всего лишь в нескольких точках (или рядом с ними), для которых характерна уникальная последовательность оснований. В настоящее время удалось выделить около 45 таких ферментов с разной специфичностью. [c.279]

Во многих случаях рестриктирующие ферменты образуют разрывы в каждой из двух цепей в местах, расположенных симметрично относительно оси симметрии второго порядка. Этого и следовало ожидать в случае, если димерный фермент связывается с большой или с малой бороздкой двойной спирали и каждый активный центр взаимодействует с одной из полинуклеотидных цепей. [c.280]

Перенос метильных групп от SAM на специфические участки ДНК— самая распространенная модификация ДНК. Наиболее часто метилируются аминогруппа в 6-м положении аденина и 5-й углеродный атом цитозина. Обычно каждую рестриктирующую нуклеазу сопровождают метилазы. [c.280]

Рестриктирующие ферменты при расшифровке нуклеотидной последовательности ДНК [c.280]

Рестрикционные эндонуклеазы первого класса узнают специфическую последовательность ДНК, но расщепляют нуклеиновую кислоту в различных местах, находящихся на неопределенном расстоянии от участка узнавания. Они содержат в одном ферментном комплексе рестриктирующую и модифицирующую активности и требуют присутствия в среде S-аденозилметионина, АТР и Mg +. [c.309]

Было подсчитано, что последовательности из шести нуклеотидов с осевой симметрией второго порядка могут встречаться в любой ДНК независимо от вида с вероятностью 1 4000. Поскольку молекулы ДНК бактерий состоят из миллионов нуклеотидных пар, вероятность того, что любая бактериальная ДНК расщепится хотя бы один раз любой данной рестриктирующей эндонуклеазой, очень велика. Однако клетка-хозяин защищает свою собственную ДНК путем метилирования одного или нескольких оснований в последовательности, подверженной рестрикции метилированная последовательность не связывается с рестриктирующей эндонуклеазой и потому не расщепляется. [c.881]

Решающий успех был достигнут благодаря трем основным достижениям. Первым из них явилось открытие рестриктирующих эндонуклеаз, которые расщепляют молекулы ДНК только в сравнительно небольшом числе специфических точек. Использование двух или большего числа рестриктирующих эндонуклеаз (табл. 27-7) позволило расщеплять молекулы ДНК на отдельные фрагменты разными способами с образованием перекрывающихся последовательностей-точно так же, как применение двух различных протеолитических ферментов (например, трипсина и химотрипсина) открыло в свое время возмож- [c.885]

В приведенном ниже описании опущены некоторые детали для того, чтобы сконцентрировать внимание на основном принципе метода. Предположим, что у нас есть полученный в результате действия рестриктирующей эндонуклеазы фрагмент ДНК размером в 10 нуклеотидных остатков с последовательностью [c.887]

Чтобы расшифровать нуклеотидную последовательность целой молекулы ДНК, сначала ее фрагментируют с помощью рестриктирующей эндонуклеазы. Затем каждый из образовавшихся фрагментов секвенируют по отдельности по схеме, приведенной на рис. 1. Во второй аликвоте исходную ДНК расщепляют в других местах, используя другую рестриктирующую эндонуклеазу, и получают второй набор фрагментов. После того как секвенирование всех фрагментов второго набора завершено, сравнение двух наборов дает возможность найти участки перекрывания, необходимые для сборки фрагментов первого набора в правильном порядке. В результате может быть установлена нуклеотидная последовательность интересующей нас природной ДНК. Иногда, для того чтобы устранить неясности в некоторых участках последовательности, оставшиеся после первых двух расщеплений, приходится анализировать третий или четвертый наборы фрагментов. [c.889]

Действие рестриктирующих эндонуклеаз. Замкнутую кольцевую вирусную ДНК обрабатывают рестриктирующей эндонуклеазой. В этой ДНК есть один сайт рестрикции со следующей структурой [c.893]

Сначала плазмиду переводят в линейную форму, расщепляя ее в одной точке рестриктирующей эндонуклеазой с образованием в месте расщепления тупых [c.985]

Рестриктирующая эндонуклеаза, под действием которой образуются тупые концы [c.986]

Рестриктирующие эндонуклеазы, детерминируемые хромосомой Е. соИ, — это крупные белки с мол. весом порядка 300 000—400 000, состоящие из полипептидных цепей трех типов. Они явно связываются со специфическими участками и неспецифически разрушают прилегающие к ним участки. Для их действия необходимо наличие АТР, ионов Mg2+ и S-аденозилметионина. Уникальная особенность этих белков состоит в способности вызывать гидролиз необычно больших количеств АТР [215]. Значение всех этих свойств рестриктирующих ферментов остается до сих пор неясным. Второй класс рестриктирующих ферментов состоит из относительно небольших мономерных или димерных белков с мол. весом 50 000—100 000. Местом атаки этих ферментов служат, как правило, нуклеотидные последовательности с локальной симметрией второго порядка [217]. Так, например, для двух рестриктирующих эндонуклеаз, детерминируемых ДНК плазмиды R-фактора Е. соН, и рестриктирующего фермента Hemophilus influenzae были идентифицированы следующие участки расщепления (в приведенной ниже схеме стрелками показаны места расщепления, звездочками — места метилирования, а точками — локальная ось симметрии второго порядка) [c.279]

Выли разработаны реальные химические методы, обеспечивающие возможность объединения фрагментов хромосом [258, 259]. Один из подходов состоит в использовании рестриктирующих эндонуклеаз для получения фрагментов ДНК с липкими концами. Уже удалось включить гены эукариот в бактериальные R-факторы и гены SV40 в фаг [c.294]

Представление о том, что носителем генетич. информации является ДНК, возникло еще в 1944. Было известно также, что ген представляет собой отрезок ДНК, кодирующий определенный белок, и что передача наследств. ин(]юр-мации между поколениями происходит посредством удвоения молекул ДНК. Но любым манипуляциям препятствовала огромная молекулярная масса ДНК, составляющая миллионы и миллиарды иа клетку, и невозможность получать химически однородные небольшие ее фрагменты. Положение изменилось, когда удалось обнаружить и выделить два рода ферментов 1) рестриктирующие эндонуклеазы (рестриктазы)-они рассекают молекулы ДНК в пределах строго определенных нуклеотидных последовательностей их описано ок. 400, наиб, употребительны рестриктазы E o RI, Hind III, Bam HI, Pst I, Sal I и др. 2) ДНК-лигазы (прежде всего фермент кишечной палочки, индуцируемый бактериофагом Т4), к-рые сшивают двухцепочечные фрагменты ДНК, восстанавливая межнуклеотндные связи в местак единичных разрывов. С помощью этих ферментов получают удобные для генетич. операций фрагменты ДНК и соединяют их в единое целое. Для такого объединения безразлично происхождение ДНК (химически у всех существ она одинакова), между тем в природе объединению генетич. информации неродственных существ препятствуют разл. межвидовые барьеры. [c.518]

Для рестриктаз третьего класса участок узнавания не обязательно должен быть симметричным, а расщепление происходит иа расстоянии 24 — 27 нуклеотидов от участка узнавания. Так же как рестриктазы первого класса, они содержат в одном комплексе и рестриктирующую. и метилирующую активности и требуют для рестрикции присутствия АТР. Пример последовательности, узнаваемой рестриктазой Есок1. относящейся к третьему классу, приведен [c.310]

ДНК бактерий данного вида защищена двумя близкими по своей специфичности ферментами 1) модифицирующей метилазой и 2) рестриктирующей эндонуклеазой. Модифицирующая метилаза отвечает за образование специфической для данного вида картины метилирования в определенньЕя коротких последова- [c.880]

Интересно, что этот короткий участок ДНК, метилированный или неметилиро-ванный, обладает внутренней симметрией относительно центральной точки, показанной красным цветом. Если повернуть этот участок на 180° в плоскости рисунка вокруг центральной точки, то он будет читаться точно так же, как до поворота. Такой тип симметрии характеризуется осью симметрии второго порядка. Больщинство проверенных последовательностей модификации-рестрикции обладают симметрией второго порядка. Рестриктирующая эндонуклеаза Hind II расщепляет обе цепи в середине этого участка в любой ДНК, в которой эта последовательность не метилирована. Будучи расщепленной таким образом, чужеродная ДНК не может быть исправлена и поэтому не может реплицироваться. [c.880]

Г0 порядка. В зависимости от типа рестриктирующей эндонуклеазы в месте расщепления двухцепочечной ДНК образуются либо тупые , т.е. заполненные концы (как в случае описанной выше Hind II), либо выступающие концы (примером может служить эндонуклеаза Есо RI из Е. соН). В последнем случае два перекрывающихся конца называют липкими, поскольку они способны образовать друг с другом комплементарные пары оснований. [c.881]

У разных видов бактерий обнаружено уже свыше 150 различных рестриктирующих эндонуклеаз. Некоторые бактерии содержат больше одного набора модифицирующих метилаз и рестриктирующих эндонуклеаз. Однако ДНК вирусов бактерий научились с помощью ряда способов преодолевать рестрикционную защиту клеток их хозяев. Некоторые вирусные ДНК содержат разного рода модифицированные основания, которые позволяют им избегать расщепления ре-стриктирующими эндонуклеазами клетки-хозяина, в которую они попали. Модифицирующими группами в таких вирусных ДНК служат метильные, ги-дрокСиметильные и глюкозильные группы. Другие вирусы в ходе эволюции приобрели такие последовательности в ДНК, которые не содержат участков, узнаваемых некоторыми рестриктирую-щими эндонуклеазами. [c.881]

Рис. 27-31. Сайты рестрикции кольцевой молекулы ДНК SV40 для трех разных рестриктирующих эндонуклеаз- со RI, Hin и Hpa 1, Число каждая из которых узнает и катализирует рас-

ЭТОМ чужеродная ДНК, не имеющая этих опознавательных метильных групп, разрущается рестриктирующими эндонуклеазами. В эукариотических ДНК присутствует большое число высокоповторяющихся коротких последовательностей, меньшее число более длинных умеренных повторов, которые, как полагают, играют регуляторную роль, и ряд уникальных (неповторяющихся) участков, представляющих собой, видимо, структурные гены. Эукариотические гены содержат вставочные нетрансли-руёмые нуклеотидные последовательности, называемые интронами, которые вставлены между транслируемыми участками, называемыми экзонами. С помощью недавно разработанных методов были определены нуклеотидные последовательности ряда генов и вирусных ДНК. [c.891]

Обнаружение рестриктирующих эндонуклеаз стало первым щагом на пути решения проблемы искусственной рекомбинации генов. Предположим, что мы хотим соединить вместе две двухцепочечные ДНК, вьщеленные из разных организмов (рис. 30-19). Каждую из них в отдельности обрабатывают одной и той же рестриктирующей эндонуклеазой, которая разрывает обе цепи ДНК с образованием в месте разрыва выступающих концов (разд. 27.24). Допустим, что в каждой из этих ДНК есть лишь [c.981]

Рис. 30-19. Использование специфической рестриктирующей эндонуклеазы, которая образует в месте разрыва выступающие концы, для расщепления двух разных ДНК (ДИК и ДНКг) и получения фрагментов для последующей рекомбинации. Поскольку многие рестриктирующие эндонуклеазы расщепляют лишь специфические участки ДНК, обладающие осевой симметрией второго порядка, образующиеся липкие концы комплементарным образом взаимодействуют с концами любой другой ДНК, разрезанной той же самой эндонуклеазой. При отжиге из соответствующих фрагментов ДНК, и ДНК могут снова образоваться исходные молекулы или же новые рекомбинантные ДНК, как это показано на рисунке. Ковалентное сшивание фрагментов осуществляется под действием ДНК-лигазы.

Из фрагментов вирусных и бактериальных хромосом уже выделен целый ряд генов. Что же касается выделения специфических генов из фрагментированных эукариотических хромосом, то реализация этой процедуры все еще остается довольно сложной и трудоемкой задачей. Существует два основных подхода для получения специфических генов, подлежащих затем рекомбинации и клонированию. В одном из них, который получил название шотган (от англ. shotgun-дробовик), всю клеточную ДНК обрабатывают рестриктирующей эндонуклеазой, образующей в местах разрыва выступающие концы. Полученные фрагменты ДНК встраивают затем в плазмиды Е. соИ, раскрытые (т.е. переведенные в линейную форму) с помощью той же самой рестриктирующей эндонуклеазы. В результате образуется чрезвычайно сложная смесь, состоящая, вероятно, из тысяч разных рекомбинантных плазмид, среди которых лишь одна может содержать нужный ген. Для поиска плазмиды, несущей этот ген, разработаны специальные процедуры, которые называют скринингом. Одна из таких процедур описана в разд. 30.17. [c.983]

Новые комбинации генов можно создать и искусственным путем в лабораторных условиях с помощью таких ферментов, как рестриктирующие эндонуклеазы, ДНК-лигаза и терминальная трансфераза. Чтобы встроить чужеродный ген в геном клеток Е. соИ, этот ген сначала пришивают к вектору, которым служит либо плазмида Е. соИ, либо ДНК фага Х. Полученная рекомбинантная ДНК может затем попасть в клетку Е. oli, ковалентно включиться в ее хромосому и в составе этой хромосомы реплицироваться. Если новый ген, содержащийся в рекомбинантной ДНК, обладает подходящими сигнальными последовательностями, указывающими начало и конец транскрипции, то такой ген будет транскрибироваться и транслироваться с образованием соответствующего белкового продукта. Многие гены из животных клеток уже были введены в бактерии, а бактериальные гены в свою очередь были встроены в эукариотические клетки. С помощью бактерий, в геномы которых введены соответствующие гены, можно получать применяемые в медицине белковые препараты-инсулин, гормон роста и интерфероны. [c.991]

Рекомбинация фрагментов, полученных с помощью рестриктирующей эндонуклеазы. Предположим, у вас есть две двухцепочечные молекулы ДНК-А и Б. Цепь 1 ДНКд имеет последовательность [c.992]

Обе ДНК расщепляют рестриктирующей эндонуклеазой Есо RI, пол) енные фрагменты смешивают, чтобы они смогли в смеси перекомбинироваться, и затем ковалентно сшивают с помощью ДНК-лигазы. Напишите последовательности всех ДНК, образующихся после рекомбинации. Укажите, какие из них окажутся новыми рекомбинантами. [c.992]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология