Рестриктирующие ферменты

Бактерии часто переваривают и разрушают ДНК вторгшихся в них вирусов или ДНК, попавшую в клетку при спаривании с бактерией несовместимого штамма. В результате исследований этого интересного явления, получившего название рестрикция, было обнаружено, что ДНК вирусов, способных к репликации лишь в определенных клетках-хозяевах, в специфических местах каким-то образом маркирована. Причем во многих случаях метками являются метильные группы. Оказалось, что соответствующим образом метилированная ДНК не расщепляется бактерией, тогда как неметилированная ДНК расщепляется высокоспецифичной эндонуклеазой именно в тех местах, в которых обычно происходит метилирование. У каждого вида бактерий (а часто даже и у отдельных штаммов в пределах данного вида) имеются свои собственные рестриктирующие ферменты. Рестриктирующие ферменты обладают очень высокой степенью специфичности и часто разрезают ДНК всего лишь в нескольких точках (или рядом с ними), для которых характерна уникальная последовательность оснований. В настоящее время удалось выделить около 45 таких ферментов с разной специфичностью. [c.279]

Если взять определенную молекулу ДНК и обработать ее подходящим рестриктирующим ферментом, то в строго определенных местах произойдут разрывы, которые разделят ДНК на ряд отдельных фрагментов. Эти фрагменты можно фракционировать по размеру методом гель-электрофореза. Для этого препарат разрезанной ДНК наносят сверху на агарозный гель. При наложении электрического поля фрагменты начнут перемещаться вниз по гелю со скоростью, зависящей от их длины. Чем короче фрагмент, тем быстрее он движется. (Пройденное расстояние обратно пропорционально логарифму длины фрагмента.) [c.44]

Во многих случаях рестриктирующие ферменты образуют разрывы в каждой из двух цепей в местах, расположенных симметрично относительно оси симметрии второго порядка. Этого и следовало ожидать в случае, если димерный фермент связывается с большой или с малой бороздкой двойной спирали и каждый активный центр взаимодействует с одной из полинуклеотидных цепей. [c.280]

Рестриктирующие ферменты при расшифровке нуклеотидной последовательности ДНК [c.280]

Рис. 3.1. Рестриктирующие ферменты расщепляют ДНК на отдельные фрагменты, которые можно разделить методом электрофореза в агарозном геле.

Затем следует построить карту ДНК. Для этого ДНК разрывают в определенных точках, расстояние между которыми можно точно измерить. Такие точные разрывы возможны благодаря рестриктирующим ферментам (ферменты рестрикции, рестриктазы), мишенью которых служат короткие специфические последовательности ДНК. Карта ДНК, полученная в результате локализации точек разрыва, называется рестрикционной картой. Она представляет собой линейную последовательность сайтов, в которых определенные рестриктирующие ферменты специфически узнают свои мишени. Расстояние между сайтами рестрикции измеряют прямо в нуклеотидных парах ДНК (сокращенно п. н. для коротких отрезков и т. (п.) н. тысяча (пар) нуклеотидов для длинных отрезков). [c.43]

Рестриктирующие ферменты расщепляют ДНК на специфические фрагменты [c.44]

Ключом к рестрикционному картированию служат свойства одного класса ферментов, обнаруженных у бактерий (более детально эти ферменты рассматриваются в гл. 34 в связи с их естественным распространением). Мы уже говорили, что рестриктирующие ферменты режут двухцепочечную ДНК в специфических участках. Каждый рестриктирующий фермент имеет свою особую мишень. Обычно это специфическая последовательность нуклеотидов длиной от 4 до 6 пар оснований. Фермент режет ДНК в каждой точке, где встречается такая последовательность. Разные рестриктирующие ферменты имеют различные последовательности-мишени. Сейчас в распоряжении исследователей находится большой набор рестриктаз. (Их применение детально описано в гл. 19.) [c.44]

Все данные, полученные при сравнении специфического действия рестриктаз А и В, сведены в рестрикционную карту на рис. 3.3. Таким образом, молекула ДНК размером в 5000 п. н. поделена на серии участков определенной длины, расположенные между участками, специфически узнаваемыми двумя рестриктирующими ферментами. [c.45]

Точковые мутации труднее локализовать на рестрикционной карте. Иногда они могут изменить сайты-мишени для рестриктирующего фермента. В противном же случае их не удастся определить, так как размеры рестрикционных фрагментов ДНК дикого типа и мутантов оказываются одинаковыми. Поэтому для локализации таких замен оснований часто необходимо определить последовательность оснований в ДНК. [c.46]

Существование полиморфизма в геноме можно установить, сравнивая рестрикционные карты разных индивидуумов. Критерием полиморфизма в этом случае служит изменение в характере расположения фрагментов, образованных в результате расщепления рестриктирующим ферментом. На рис. 3.5 показано, что если в геноме одного индивидуума имеется сайт-мишень для рестриктирующего фермента, отсутствующий у другого, то в результате дополнительного расщепления в первом геноме образуется два фрагмента, соответствующих в совокупности одному целому фрагменту во втором геноме. [c.47]

Расщепление рестриктирующим ферментом и электрофорез [c.47]

Выделение ДНК и расщепление рестриктирующим ферментом [c.377]

Рассмотрим последовательность только для одной нуклеосомы. При расщеплении нуклеазой микрококков образуется мономерный фрагмент, состоящий из специфической последовательности. Если выделить ДНК и расщепить ее рестриктирующим ферментом, для которого имеется только один сайт рестрикции на этом фрагменте, то ДНК будет разрезана только в одной точке. При этом образуются два фрагмента, каждый с уникальным размером. Продукты двойного расщепления нуклеазой микрококков и рестриктирующим ферментом разделяют с помощью электрофореза в геле. Для идентификации фрагментов, образованных в результате двойного расщепления, используют специальный зонд, представляющий собой последовательность ДНК, непосредственно примыкающую к сайту рестрикции (с одной стороны). Этот метод называют непрямым концевым мечением (не совсем соответствующее название). [c.377]

Отдельный мономерный фрагмент, полученный после расщепления нуклеазой микрококков, может быть представлен разнообразием последовательностей под действием рестриктирующего фермента этот фрагмент распадается, образуя непрерывную серию более мелких фрагментов. Если мы примем, что наименьший фрагмент, который можно идентифицировать методом гибридизации, содержит 20 пар нуклеотидов, то в описанном выше опыте мы получим размазанное пятно, содержащее фрагменты от 20 п.н. до полной длины мономерной ДНК. [c.377]

ДНК выделяют и расщепляют рестриктирующим ферментом [c.381]

Расщепление рестриктирующим ферментом [c.389]

Зонд определяет полосу, соответствующую фрагменту, разрезанному с одного конца рестриктирующим ферментом, а с другого ДНКазой I [c.389]

В сверхчувствительной области гена (3-глобина цыпленка нуклеаза S1 расщепляет сайты, лежащие в участках с необычной последовательностью. Это отрезки ДНК, одна из цепей которых целиком состоит из пуринов, а другая из пиримидинов. Некоторые особенности сайтов расщепления свидетельствуют о том, что они представляют собой не одноцепочечные ДНК их узнают рестриктирующие ферменты, действующие только на двухцепочечную ДНК, и не узнает фермент, специфичный к одноцепочечной ДНК. Из этого можно, очевидно, сделать вывод, что такие сайты имеют несколько необычную структуру, что позволяет нуклеазе S1 узнавать их, хотя при этом не образуется настоящих одноцепочечных участков. [c.391]

Удаление центрального участка , рестриктирующим ферментом [c.212]

Рестриктирующие эндонуклеазы, детерминируемые хромосомой Е. соИ, — это крупные белки с мол. весом порядка 300 000—400 000, состоящие из полипептидных цепей трех типов. Они явно связываются со специфическими участками и неспецифически разрушают прилегающие к ним участки. Для их действия необходимо наличие АТР, ионов Mg2+ и S-аденозилметионина. Уникальная особенность этих белков состоит в способности вызывать гидролиз необычно больших количеств АТР [215]. Значение всех этих свойств рестриктирующих ферментов остается до сих пор неясным. Второй класс рестриктирующих ферментов состоит из относительно небольших мономерных или димерных белков с мол. весом 50 000—100 000. Местом атаки этих ферментов служат, как правило, нуклеотидные последовательности с локальной симметрией второго порядка [217]. Так, например, для двух рестриктирующих эндонуклеаз, детерминируемых ДНК плазмиды R-фактора Е. соН, и рестриктирующего фермента Hemophilus influenzae были идентифицированы следующие участки расщепления (в приведенной ниже схеме стрелками показаны места расщепления, звездочками — места метилирования, а точками — локальная ось симметрии второго порядка) [c.279]

Более детальный анализ последовательностей, необходимых для функционирования промотора, производится с помощью метода сканирования линкером. Этот подход позволяет вводить наборы мутантных последовательностей в определенные участки гена. Постановка опыта изображена на рис. 11.7. В область исследуемого гена вводят делеционные мутации. В одном случае создается набор фрагментов, имеющих делеции с 5 -конца гена, в другом случае-с З -конца. Делектируемые области заменяются последовательностью линкера, который представляет собой короткий синтетический олигонуклеотид, содержащий участок узнавания определенной рестриктазой. Фрагменты обоих типов расщепляют рестриктирующей эндонуклеазой и затем соединяют друг с другом, таким образом, чтобы произошло объединение линкеров (смотри реакцию расщепления рестриктирующими ферментами в гл. 17). [c.152]

Распределение метильных групп можно исследовать, используя рестриктирующие ферменты, которые расщепляют сайты-мишени, содержащие СО-дуплеты. На рис. 30.13 сопоставляются два фермента с рестриктирующей активностью. Это изосхизомеры, т.е. ферменты, которые расщепляют в качестве мишени одну и ту же последовательность ДНК, но по-разному реагируют на ее метилирование. [c.386]

Инвариантна ли картина метилирования, или она меняется в зависимости от конкретных условий Отдельные сайты были исследованы в нескольких случаях, в том числе в генах, кодирующих клеточный белок в тандемном кластере рДНК и в последовательности нескольких интегрированных или свободных вирусных геномов. Сайты, идентифицированные с использованием рестриктирующих ферментов,-это лишь некоторые из метилированных последовательностей, но мы полагаем, что их поведение типично для всех таких сайтов. [c.386]

Рестриктирующий фермент MspI расщепляет два сайта этой области. Часть фрагментов, образованных этим ферментом, оказывается в виде свободной ДНК, Таким образом, в период транскрипции область, расположенная от — 60 до — 260, становится предпочтительно чувствительной к нуклеазам, [c.390]

Особенно хорошо изучена чувствительная к нуклеазе область мини-хромосомы вируса SV40. Короткий сегмент около точки начала репликации, непосредственно предшествующий промотору для поздней единицы репликации, предпочтительно расщепляется ДНКазой I, нуклеазой микрококков и другими нуклеазами (в том числе рестриктирующими ферментами). По минимальной оценке область предпочтительного расщепления имеет в длину 400 п. н., причем этот фрагмент может быть вырезан в виде свободной ДНК. [c.391]

Состояние мини-хромосомы вируса SV40 можно увидеть под электронным микроскопом. В участке, составляющем до 20% всего образца, заметен пробел в нуклеосомной организации. Это хорошо видно на электронной микрофотографии (рис. 30.19). Пробел длиной около 120 нм (примерно 350 п.н.) с обеих сторон окружен нуклеосомами, занимающими весь остальной геном. Положение пробела можно определить, расщепив кольцевую мини-хромосому с помощью рестриктирующего фермента, для которого известен лишь один сайт-мишень. Видимый пробел соответствует области, чувствительной к нуклеазам. Это прямо показывает, что повышенная чувствительность к нуклеазам коррелирует с отсутствием нуклеосом. [c.391]

Наилучший способ определения структуры вирусной геномной РНК — анализ провирусной ДНК-формы генома, присутствующей в инфицированных клетках, например, с помощью блот-гибридизации клеточной ДНК [39]. На рис. 9.5 показан вариант такого анализа, демонстрирующий удаление интронов из гека, клонированного в ретровирусном векторе. Как правило, клеточную ДНК расщепляют рестриктирующими ферментами, которые узнают специфические сайты в пределах каждого из вирусных LTR, но не затрагивают внутренние последовательности так, в случае векторов семейства Mo-MLV для этой цели часто используют рестриктазы Xbal и 5ас1. Следует подчеркнуть, что в тех случаях, когда инфицированные клетки имеют мышиное происхождение, гибридизационная проба для блот-анализа не должна содержать MLV-последовательностей. В противном случае родственные MLV эндогенные провирусы ослож- нят интерпретацию картины гибридизации. При необходимости проводят детальное структурное картирование или секвенирование ДНК рекомбинантного провируса, используя клонированную провирусную ДНК. [c.299]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология