Ренатурация гибридизация ДНК

Ранее П. Доти (США) и его сотрудники показали, что двойную спираль ДНК можно расплетать или денатурировать, применяя различные воздействия (повышение температуры, изменение pH и др.). В то же время, если инкубировать денатурированную одноцепочечную ДНК при температуре ниже той, которая вызывает денатурацию, комплементарные цепи реагируют между собою, вновь образуя двойную спираль, — происходит ренатурация ДНК. Если к ДНК добавить комплементарную РНК, может происходитьобразование гибридов ДНК—РНК — гибридизация, которая в дальнейшем стала одним из мощнейших методов изучения нуклеиновых кислот, позволяя выявлять комплементарные молекулы. [c.20]

Рис. 8.4. Олигонуклеотид-направленный мутагенез с использованием ПЦР. Реакцию проводят в двух пробирках, в каждой из которых содержится одинаковая двухцепочечная плазмидная ДНК, но разные наборы праймеров. Праймеры 1 и 3 содержат один неспаривающийся нуклеотид и комплементарны разным цепям плазмидной ДНК. Праймеры 2 и 4 полностью комплементарны соответствующим участкам плазмидной ДНК и тоже гибридизуются с разными цепями. Положение сайтов гибридизации для праймеров каждой пары различается, но их концы стыкуются. В результате ПЦР-амплификации образуются линейные молекулы. По окончании реакции содержимое пробирок смещивают и проводят денатурацию, а затем ренатурацию. В результате кроме двух исходных линейных амплифицированных молекул образуются две кольцевые плазмидные ДНК, каждая с двумя одноцепочечными разрывами. После трансформации кольцевыми молекулами клеток Е. соН разрывы репарируются ферментами клетки-хозяина, и плазмида может реплицироваться независимо. Линейные молекулы ДНК в Е. oli не сохраняются.

В молекулярной биологии широко используется способность денатурированных ДНК ренатурировать с восстановлением исходной двуспиральной структуры. Она лежит в основе метода молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот, который позволяет выявлять степень сходства различных ДНК (а также РНК). Для этого денатурированную ДНК (если изучается гибридизация двух различных нуклеиновых кислот, то одна из них несет радиоактивную метку) помещают в условия, оптимальные для образования двойных спиралей (ионная сила раствора — около 0,2 температу за — на 10—20 "С ниже Тт нативной ДНК). В случае полностью комплементарных цепей ДНК со временем они целиком превратятся в двуспиральные молекулы. Если в смеси присутствуют как комплементарные, так и некомплементарные цепи ДНК, то после ренатурации первых тем или иным способом определяют долю двуспиральных молекул. В настоящее время широко распространены методы, когда денатурированные молекулы ДНК одного типа закрепляются на нитроцеллюлозных фильтрах, которые затем помещают в раствор ДНК (или РНК) другого типа. После образования двуспиральных комплексов на фильтрах они легко могут быть отмыты от несвязав-шейся ДНК- Этот же подход используется при выявлении цепей ДНК (или РНК), комплементарных другим ДНК (или РНК), после разделения их электрофорезом в гелях. [c.30]

Разумеется, без достаточных экспериментальных подтверждений мы не можем настаивать на таком объяснении, однако это и не так уже существенно. Важен надежно установленный экспериментальный факт для элюции нативной ДНК (или двунитевой РНК, а также гибридных молекул ДНК—РНК) с оксиапатита требуется почти вдвое более высокая концентрация фосфатного буфера, чем для элюции денатурированной ДНК или однонитевой РНК. Это обстоятельство открыло возможность быстрого и надежного отделения двунитевых молекул нуклеиновых кислот от однонитевых, что сыграло очень важную роль как в изучении структуры генома (исследования кинетики ренатурации), так и в развитии современных методов генной инженерии (гибридизация молекул НК и др.). Как и в случае кислых белков, присутствие даже относительно высоких концентраций неорганических солей в элюирующем буфере практически не сказывается на процессах элюции одно- и двунитевых молекул НК с оксиапатита. Вместе с тем, варьируя концентрацию Na l или КС1 в буфере, можно управлять изменением конформации самих нуклеиновых кислот, а также характером их гибридизации (например, отделять истинные , полноценные, гибридные молекулы от несовершенных гибридов ). [c.230]

В простейшей форме комплементарные взаимодействия, играющие в общей рекомбинации центральную роль, можно воспроизвести в экспериментах ш vitro по ренатурации ДНК, разделенной на отдельные цепи. Такая ренатурация (или гибридизация) происходит, когда в растворе вследствие случайного соударения одиночных цепей ДНК комплементарные нуклеотидные последовательности оказываются одна напротив другой и образуют короткий отрезок двойной спирали. За этим сравнительно медленным этапом нуклеации спирали следует очень быстрый этап застегивания молнии двойная спираль при этом растет до тех пор, пока не образуется максимально возможное число водородных связей (рис. 5-59). Для образования таким путем новой двойной спирали разделившиеся цепи во время отжига должны быть выпрямлены, чтобы их основания были открытыми. По этой причине эксперименты с гибридизацией ДНК in vitro проводят при высокой температуре или в присутствии таких органических растворителей, как формамид в этих условиях плавятся и короткие спирали ( шпильки ), возникающие в одиночной цепи ДНК вследствие комплементарных взаимодействий при ее складывании саму на себя. Бактериальные клетки не переносят, разумеется, столь жестких воздействий. В них распрямление спиралей достигается под воздействием специального дестабилизирующего белка, или SSB-белка. У Е. oh SSB-белок необходим и для репликации ДНК, и для общей рекомбинации кооперативно связываясь с сахарофосфат- [c.304]

По температуре денатурации — ренатурации можно оценить степень комплементарности нуклеиновых оснований в цепях ДНК. Для денатурации сегментов ДНК, характеризующихся высоким уровнем комплементарности. требуются соответственно большие затраты энергии. Расхождение цепей таких фрагментов ДНК происходит соответственно при более высокой температуре. Это физическое явление используется на практике для определения степени сродства (гомологии) различных нуклеиновых кислот и лежит в основе метода гибридизации (одного из главных в генной инженерии). [c.36]

Кинетика гибридизации второго порядка нескольких очишенных гомогенных препаратов ДНК представлена на рис. 7.27. Как и во многих эю пери-ментах по гибридизации, ДНК перед денатурацией и реассоциацией была разрезана на фрагменты длиной около 400 пар оснований. Обратите внимание на то, что шкала ot логарифмическая это облегчает сравнительный анализ данных. Соответствие кинетических кривых простой реакции второго порядка следует из того, что ренатурация на 90% укладывается в интервал значений ot, охватывающий два порядка величины. [c.340]

B. ренатурация (гибридизация) ДНК нуклеация спирали [c.296]

Ренатурация позволяет получать гибридные двойные спирали из ДНК различного происхождения. Получены гибриды ДНК, выделенных из различных штаммов Е. oli, и межвидовые бактериальные гибриды. Гибридизация ДНК вскрывает эволюционногенетические связи между бактериями. [c.246]

Мы остановимся здесь на кинетике переходов между одно- и двухцепочечными формами в простых модельных олигонуклеотидных комплексах, а затем покажем, как использовать эту информацию при анализе кинетики денатурации и ренатурации ДНК. Этот анализ послужит основой для выяснения количественных закономерностей гибридизации нуклеиновых кислот, одной из наиболее часто используемых методик в современной молекулярной биологии эукариот. [c.332]

Денатурация и ренатурация мини-хромосомы или продуктов ее расщепления рестриктазами вызывают изменение электрофоретической картины, поскольку левая и правая половины одноцепочечных молекул, образовавшихся из центрального фрагмента, комплементарны и, следовательно, могут гибридизоваться сами на себя. Благодаря тому что две комплементарные половины входят в состав одной и той же молекулы, они гибридизуются друг с другом намного быстрее, чем с другими молекулами. Гибридизация сама на себя приводит к тому, что наблюдаемый размер молекулы уменьшается в 2 раза. Таким образом, не разрезанная рестриктазой хромосома после денатурации и ренатурации уменьшается в размере с 21 до 10,5 т. п. н. Аналогичным [c.384]

Реконструкцию структуры, состоящей из субъединиц, из отдельных субъединиц различных структур называют гибридизацией, Механизмом этого процесса может быть ренатурация или реассоциация. Например, если ДНК, у которой цепи содержат изотоп денатурирует и смешивается с одноцепочечной ДНК (денатурированной), меченной изотопом а затем подверга- [c.22]

Скорость восстановления (ренатурации) двойной спирали зависит от вероятности столкновения двух комплементарных нуклеотидных последовательностей и их концентрации в растворе. Скорость реакции гибридизации можно использовать для определения концентрации любьсс последовательностей РНК или ДНК в смеси, содержащей и другие фрагменты нуклеиновых кислот. Для этого необходимо иметь чистый одноцепочечный фрагмент ДНК, комплементарный к тому фрагменту, который надлежит выявить. Обычно фрагмент ДНК, полученный клонированием либо химическим путем, метят по Р в целях прослеживания включения фрагмента в состав дуплексов при гибридизации. Одноцепочеч- [c.110]

Гибридизация (ренатурация) — взаимодействие комплементарных цепей ДНК (или ДНК и РНК), приводящее к образованию двухцепочечной молекулы. [c.352]

А. Мармур и П. Доти Открыто явление ренатурации ДНК и установлены точность и специфичность реакции гибридизации нуклеиновых кислот [c.105]

Разрушение и восстановление двуспиральных структур. Денатурация, ренатурация, и гибридизация. Д спиралььые структуры очень стабильны в физиологических условиях при значениях рН, близких к нейтральным, температурах около 30 — 40 и в присутствии 0,15 моля соли. Одиако увеличение или уменьшение pH, повышение температуры и добавление в среду некоторых веществ, таких, например, как мочевина, приводит к разрушению даух-цепочечной структуры, предельным случаем которого является Оена-турация, т. е. полное разделение отдельных нитей. [c.342]

Методы гибридизации ДНК/ДНК и ДНК/рРНК получили в последние годы широкое распространение при идентификации новых щтаммов бактерий. Они позволяют установить степень генетического родства изучаемого штамма с определенним родом, видом или выявить штаммовые различия. Принцип метода заключается в денатурации выделенной двухцепочечной ДНК нагреванием и фиксации разошедшихся цепей на фильтрах. При понижении температуры возможна ренатурация цепей, причем соединиться с цепью может только комплементарная ей последовательность оснований, а температура связывания во многом определяет результаты опыта. Количество ренатурированной двуспиральной ДНК служит прямой мерой сходства геномов сравниваемых организмов, причем последовательности, образующие двухцепочечные комплексы, не обязательно комплементарны по всем нуклеотидам. [c.145]

Температуру гибридизации подбирают для каждого эксперимента однако можно сформулировать следуюгцне основные правила. 1. Если РНК обладает отчетливо выраженной вторичной структурой (нанример, транспортная РНК), температура гибридизации должна быть выше температуры плавления этой РНК. 2. Нри продолжительной гибридизации темнература должна быть такой, чтобы скорость образования гибридов превышала скорость тепловой деградации РНК. Для РНК со слабо выраженной вторичной структурой эта температура равна 55°. 3. Когда гибридизацию проводят в растворе с относительно большими количествами ДНК, температуру следует понизить, чтобы подавить конкурентный процесс ренатурации ДНК. 4. Для РНК с низким молекулярным весом (менее 50 нуклеотидов) температура гибридизации также должна быть низкой (это необходимо для стабилизации структуры гибридов). [c.148]

Рис. 84. Гибридизация путем совместной денатурации и ренатурации ( отжигом ) ДНК из Вас. виЬИИз, выращенных на средах с N и с N1 .

Рис. 87. Гибридизация ДНК двух различных видов бактерий Вас. аиЫШа и Вас. паШ) при совместной денатурации и ренатурации ( отжиге ).

Ренатурации ДНК можно избежать двумя путями. Гибридизацию можно проводить при низких температурах и низкой копцентрации ДНК (мепее 5 мкг1мл), по относительно высокой концентрации РНК [1]. В этих условиях за 24 час или более продолжительное время ренатурируется [c.148]

Открытие повторяющихся последовательностей [27]. Примерно в те же годы начались исследования, позволившие установить другое фундаментальное отличие организации генома у высших организмов, а именно существование в нем многочисленных повторяющихся последовательностей. Эти работы были выполнены группой Р. Браттена (США). Авторы изучали процессы ренатурации и гибридизации нуклеиновых кислот. [c.20]

Для проведения гибридизации клетки изучаемого штамма разрушают тем или иным способом (см. 8.1), выделяют ДНК, фрагментируют ее ультразвуком на кусочки длиной 300—350 пар оснований (определяется электрофорезом в 1%-ной агарозе), денатурируют нагреванием и закрепляют на нитроцеллюлозных фильтрах, ДНК сравниваемого штамма готовят таким же способом, вводят реактивную метку ник-трансляцией с помощью меченого нукле-озид-5 -трифосфата при одновременном действии ДНКазы 1 и ДНК полимеразы 1 Е. oli и используют для гибридизации. Ее чаще всего проводят по методу Денхардта в 20%-ном формамиде при 62° в течение 18—24 ч ( мягкая ренатурация ), отмывают от несвязавшейся меченой ДНК, и радиоактивность фильтров просчитывают в сцинтилляционном счетчике. Гибридизацию гомологичных ДНК принимают за 100% и рассчитывают проценты связанной исследуемой ДНК с ДНК реперного штамма. Процент связанной ДНК отражает степень гомологии молекул и служит показателем родства штаммов. Аналогичная реассоциация может быть осуществлена между молекулами ДНК и рРНК, поскольку двойные спирали образуются также между одноцепочечными ДНК и комплементарными цепями РНК. Подробнее методы описаны в справочном руководстве (Герхард и др,, 1984). [c.146]

Справочник химика 21

Химия и химическая технология